抗新生血管生成基因治療及VEGFR2酪氨酸激酶抑制劑的研究.pdf

1、目的： 以復(fù)制缺陷型重組腺病毒為載體攜帶可溶性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR2)基因silk-1，體外觀察sFlk-1的表達分泌對于血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制能力，并進一步深入研究Ad.sFlk-1在體內(nèi)對大鼠角膜新生血管及腫瘤新生血管的抑制作用。并以VEGFR2膜內(nèi)段Flk-1/KDR激酶為靶點，設(shè)計Flk-1/KDR激酶抑制劑的藥效團模型，闡明Flk-1/KDR激酶抑制劑的結(jié)構(gòu)特征，以期發(fā)現(xiàn)新的、潛在的Flk-1/KDR

2、激酶抑制劑先導(dǎo)化合物分子。 方法： CMV作為啟動子的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad.sflk-1，經(jīng)空斑篩選、擴增、密度梯度超速離心純化和滴度測定。Westernblotting檢測Ad.sFlk-1在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19、人脈絡(luò)膜惡性黑色素瘤細(xì)胞OCM-1中的表達。CCK-8顯色評估Ad.sflk-1感染ARPE-19、OCM-1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制效果。然后，構(gòu)建SD大

3、鼠角膜新生血管模型和人脈絡(luò)膜惡性黑色素瘤裸鼠模型，進一步研究以VEGF為靶點的Ad.sFlk-1在體內(nèi)對新生血管形成及腫瘤生長的抑制作用。計算機輔助設(shè)計Flk-1/KDR激酶抑制劑的三維藥效團模型，并將藥效團模型作為提問結(jié)構(gòu)進行中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫(TraditionalChineseMedicinesDatabase，TCMD)虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)新的潛在先導(dǎo)化合物分子，通過分子對接的方法來進一步闡明Flk-1/KDR激酶與其小分子抑制劑的相互作

4、用機制。 結(jié)果： 1.Ad.sFlk-1體外對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制實驗與對照組Ad.null比較，Ad.sflk-1感染ARPE-19細(xì)胞、OCM-1細(xì)胞后的條件培養(yǎng)基對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制分別達到58.39％和58.10％。 2.Ad.sFlk-1體內(nèi)對新生血管生長的抑制情況在SD大鼠角膜堿燒傷后，Ad.sflk-1治療組角膜新生血管生長抑制效果明顯。在堿燒傷第7天，Ad.null和

5、PBS對照組中，角膜新生血管嚴(yán)重程度達到“++～+++(moderatetosevere)”的比例分別為62.5％和75.0％，而Ad.sflk-1治療組的比例為0％，與對照組比較，新生血管嚴(yán)重程度等級明顯較小(p＜0.005)。在堿燒傷第14天，Ad.null和PBS對照組中，角膜新生血管嚴(yán)重程度達到“++～+++”的比例分別為75.0％和87.5％，Ad.sflk-1治療組的比例仍為0％，與對照組比較，新生血管嚴(yán)重程度等級差異顯著(

6、p＜0.005)。 免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，治療組前房Ad.sflk-1注射后，在角膜內(nèi)皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)檢測到目的蛋白sFlk-1的表達，Ad.null和PBS對照組的角膜組織中沒有檢測到sFlk-1的表達。 3.Ad.sFlk-1體內(nèi)對腫瘤生長的抑制作用腫瘤生長曲線顯示：從治療開始后的第8天起，Ad.sflk-1治療組，與Ad.null和PBS對照組相比，腫瘤生長減慢。 治療結(jié)束時，Ad.null和PBS對照組、

7、Ad.sflk-1治療組，裸鼠移植瘤體積分別為：2021.12±504.18mm3、1917.48±234.01mm3、713.03±236.18mm3。統(tǒng)計學(xué)分析，Ad.sflk-1治療組與Ad.null、PBS對照組比較，裸鼠移植瘤體積明顯較小(p＜0.05；p＜0.05)。處死小鼠后剝離腫瘤，稱取腫瘤的重量。與Ad.null、PBS對照組比較，Ad.sflk-1治療組的腫瘤抑制率分別為53.05％和52.41％。 病理切片

8、發(fā)現(xiàn)腫瘤經(jīng)過Ad.sflk-1治療后，腫瘤內(nèi)有廣泛的壞死。對照組病理切片無明顯壞死區(qū)域。免疫組織化學(xué)染色顯示治療組微血管密度(MVD)低于于對照組。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，治療組平均微血管密度為5.87±0.27，Ad.Null、PBS對照組平均微血管密度分別為13.03±0.39、12.50±0.35(p＜0.05；p＜0.05)。Ad.Null對照組與PBS對照組比較，平均微血管密度沒有顯著性差別(p＞0.05)。 4.Flk-1/K

9、DR激酶抑制劑效團模型設(shè)計和數(shù)據(jù)庫篩選由28個已知的Flk-1/KDR激酶小分子抑制劑組成的訓(xùn)練集分子，經(jīng)CATALYSTHypoGen軟件計算分析，得到打分評價最好的藥效團模型Hypol(△cost=75.184，correlation=0.911)。對藥效團模型Hypol的合理性進行評價，結(jié)果顯示藥效團模型Hypol能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測訓(xùn)練集分子和測試集分子的IC50值，說明藥效團模型Hypol是合理的，并具有較好的預(yù)測能力。將藥效團模

10、型Hypol作為提問結(jié)構(gòu)進行中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選，搜索到一個打分評價較高、并且符合“類藥五原則”的目標(biāo)小分子化合物(分子編號：Compound_Number_5688)。Flk-1/KDR激酶(PDBcode:1YWN)與目標(biāo)化合物進行柔性分子對接，對接結(jié)果與Flk-1/KDR激酶與其抑制劑4-氨基-呋喃并[2,3-d]嘧啶(4-amino-furo[2,3-d]pyrimidine)的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDBcode:1YWN)中所得到的