RhoA-Rho激酶信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:糖尿病性心肌病(DC)，是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為心室舒張功能受損，最終發(fā)展為心力衰竭，這與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)病率和高病死率密切相關(guān)。心肌細(xì)胞凋亡在DC的形成中起著重要作用，是DC主要的病理特征之一。因此，更好地了解高血糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)病機(jī)制，為DC的防治提供新的策略是非常必要的。RhoA/Rho激酶(ROCK)信號(hào)通路有著“分子開關(guān)”的作用，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的收縮、粘附、增殖和凋亡等多種生物學(xué)行為和功能。有研究

2、表明在心肌缺血再灌注損傷中，ROCK介導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡。本研究通過觀察體外高糖條件下心肌細(xì)胞的凋亡情況并應(yīng)用ROCK特異性抑制劑法舒地爾進(jìn)行干預(yù)，探討RhoA/ROCK通路在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用，旨在為DC提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
　　方法:取出生后1-3天的SD大鼠，組織消化法進(jìn)行心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行心肌細(xì)胞活力鑒定，采用細(xì)胞免疫化學(xué)法進(jìn)行心肌細(xì)胞鑒定。將心肌細(xì)胞分為9組:正常對(duì)照組（NG:含5.5mmol/L葡

3、萄糖）、高糖組（HG:含25mmol/L葡萄糖）、高滲透壓組（OSM:5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇）、正常糖濃度+法舒地爾組（50、75和100μmol/L）、高糖濃度+法舒地爾組（50、75和100μmol/L），培養(yǎng)72小時(shí)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡率并分析細(xì)胞周期，應(yīng)用Westernblotting檢測(cè)磷酸化MYPT1水平、Bax/Bcl-2、caspase3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　

4、1、高糖和法舒地爾對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響:從流式結(jié)果分析，與對(duì)照組相比，高糖組心肌細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01）;與高糖組比較，高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);當(dāng)高糖中加入法舒地爾100μmol/L時(shí)，凋亡率與對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05);高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾(50、75和

5、100μmol/L）與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2、高糖和法舒地爾對(duì)心肌細(xì)胞周期的影響:從細(xì)胞周期結(jié)果分析，與對(duì)照組相比，高糖組心肌細(xì)胞處于G0期細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P＜0.01);與高糖組相比，高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，G0期細(xì)胞數(shù)量顯著下降(P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/

6、L）與對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。高糖組G2期細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著下降(P＜0.01);高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，G2期細(xì)胞數(shù)量較高糖組顯著升高(P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);當(dāng)法舒地爾濃度為100μmol/L時(shí)，與對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。高糖組S期細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著下降(P＜0.01);高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）后，

7、S期細(xì)胞數(shù)量較高糖組顯著升高(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);當(dāng)法舒地爾濃度為100μmol/L時(shí)，與對(duì)照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）時(shí)G2期、S期細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3、高糖和法舒地爾對(duì)ROCK活性的影響:肌球蛋白磷酸酯酶靶點(diǎn)亞單位1(MYPT1)是ROCK

8、的主要底物之一，磷酸化的MYPT1是ROCK信號(hào)通路激活的標(biāo)志，因此檢測(cè)磷酸化MYPT1水平來反應(yīng)ROCK的活性。與對(duì)照組相比，高糖組磷酸化MYPT1水平顯著升高(P＜0.01)。與高糖組相比，高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）顯著抑制了磷酸化MYPT1水平的增加(P＜0.01);且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);高滲透壓組及正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）與對(duì)照組相比無顯著性差

9、異(P＞0.05)。
　　4、高糖和法舒地爾對(duì)Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達(dá)的影響:各組Bcl-2表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);與對(duì)照組相比，高糖組Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01);在高糖中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L），Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達(dá)較高糖組顯著下降(P＜0.01)，且三組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。當(dāng)高糖

10、中加入法舒地爾100μmol/L時(shí)與對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05);高滲透壓組、正常糖濃度中加入法舒地爾（50、75和100μmol/L）與對(duì)照組相比，Bax/Bcl-2比值和caspase3蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯于G0期;
　　2、高糖通過激活RhoA/ROCK信號(hào)通路，上調(diào)Bax和casepase3表達(dá)從而介導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡;ROC