犬去細胞喉支架的生物力學(xué)研究.pdf

1、全喉切除術(shù)使大量晚期喉癌病人的生命得以挽救，但同時也造成喉功能的永久喪失，嚴重影響了患者術(shù)后的生活質(zhì)量，目前仍然沒有理想的修復(fù)重建方法。為解決這一問題，人們嘗試進行喉移植，這一方法卻帶來了新的問題：一方面同種異體的人類喉移植供體來源不足；另一方面嚴重的免疫排斥反應(yīng)限制了喉移植的開展，終身應(yīng)用免疫抑制劑可部分降低免疫排斥對移植物的破壞作用，但易引起患者腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、感染和免疫力低下等問題。組織工程方法的不斷發(fā)展為很多組織和器官的修復(fù)重建提

2、供了可能。在皮膚、軟骨等較簡單組織的研究取得重大突破的啟示下，研究人員也嘗試利用組織工程方法再造全喉。由于全喉結(jié)構(gòu)精細復(fù)雜，目前研究工作多集中在部分喉缺損的重建方面，全喉作為整體進行組織工程再造還需要在理論和技術(shù)上進一步創(chuàng)新。近年來去細胞生物支架研究的不斷發(fā)展為這一難題的解決提供了新思路,去細胞技術(shù)在有效去除器官或組織內(nèi)細胞的同時保留了最接近機體的天然結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。理想的組織工程支架材料除了具有一定的理化性能之外，還需要有一定的機械強度

3、維持形態(tài)。侯楠等利用動脈灌注的方法去除了兔喉黏膜和肌肉內(nèi)細胞，保留軟骨組織維持喉形態(tài)，得到完整的去細胞全喉支架。隨后取骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨骼肌細胞后接種于喉支架的去細胞基質(zhì)中。在移植入體內(nèi)培養(yǎng)后有肌束樣組織出現(xiàn)，馬瑞娜等還對灌注得到的兔去細胞全喉支架進行免疫學(xué)研究，結(jié)果顯示該支架生物相容性好，免疫原性低。但灌注方法對軟骨支架是否破壞了軟骨的生物力學(xué)性能，喉支架還能否滿足支撐作用仍不確定。
　　本研究旨在利用完整喉軟骨做支架

4、，通過雙側(cè)顱甲動脈順行持續(xù)注入去離子劑，有效去除喉部肌群和黏膜等免疫原性強的組織，制備出低免疫原性的犬去細胞喉支架，并明確該支架在灌注前后生物力學(xué)性能是否改變，進一步評價同種異體生物人工喉支架的性能，為全喉重建提供新方法。
　　目的:
　　1.在兔喉灌注的基礎(chǔ)上，改良灌注方法制備去細胞犬喉支架。探討制備犬喉支架的可行性和尋找最佳灌注方法。
　　2.對正常未灌注喉的軟骨組織和灌注后的去細胞喉支架的軟骨組織進行組織學(xué)和力學(xué)

5、性能的比較，明確灌注法制備的去細胞喉支架的生物力學(xué)性能是否發(fā)生了顯著改變，能否滿足支架再植入體內(nèi)的力學(xué)要求，為下一步喉缺損的修復(fù)提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.灌注法制備犬去細胞全喉支架
　　取離體犬全喉通過雙側(cè)顱甲動脈順行持續(xù)注入去離子劑，有效去除喉部肌群和黏膜等免疫原性強的組織，保留喉部肌肉的細胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和完整喉軟骨支架，制備出低免疫原性的犬去細胞喉支架，并對制備的去細胞全喉支架進行大體、組織學(xué)和

6、掃描電鏡觀察。
　　2.犬去細胞全喉支架的生物力學(xué)研究
　　對灌注法制備的去細胞全喉支架和正常未灌注喉進行Masson三色、阿爾新藍染色觀察，利用專業(yè)圖像分析軟件IPP(image-proplus)對切片行膠原和糖胺聚糖含量定量分析；掃描電鏡觀察和生物力學(xué)檢測。
　　結(jié)果:
　　1.灌注法制備犬去細胞全喉支架
　　大體觀察：對照組新鮮離體喉顏色鮮紅，結(jié)構(gòu)完整；灌注組離體喉經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）灌注三小時

7、后環(huán)甲肌可透明，20h后肌肉及粘膜完全透明,喉顏色蒼白，結(jié)構(gòu)完整未出現(xiàn)塌陷、變形，除顏色改變外形態(tài)與對照組喉相比無明顯變化。組織病理學(xué)觀察：HE染色示對照組喉肌纖維束完整，肌細胞存在，軟骨細胞充填于軟骨陷窩中；實驗組喉肌細胞已去除，纖維結(jié)構(gòu)仍存在且保留了細胞外基質(zhì)的方向性，軟骨結(jié)構(gòu)完整，大量活性細胞充填于軟骨陷窩內(nèi)。掃描電鏡觀察：對照組肌肉結(jié)構(gòu)完整且無孔隙。灌注組肌肉細胞已完全去掉，纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)未破壞。
　　2.犬去細胞全喉支架的

8、生物力學(xué)研究
　　Masson三色、阿爾新藍染色：IPP軟件分析切片結(jié)果顯示對照組和灌注組無明顯差異（P值均>0.05）；掃描電鏡觀察軟骨基質(zhì)：灌注組軟骨基質(zhì)膠原纖維與對照組相比無明顯變化，未見明顯斷裂；生物力學(xué)檢測：壓凹試驗和拉伸試驗對照組和灌注組無統(tǒng)計學(xué)差異（甲狀軟骨壓凹試驗，環(huán)狀軟骨壓凹試驗，甲狀軟骨拉伸試驗P值均>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.通過改良灌注法可有效去除犬喉的肌肉和黏膜，保留喉部肌肉細胞外基質(zhì)