腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)作用機制的實驗研究.pdf

1、背景與目的：支氣管哮喘是兒童最常見的慢性變應(yīng)性疾病，在過去三十年中的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，嚴重影響了兒童尤其是嬰幼兒的生活質(zhì)量，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。人體腸道正常菌群對機體具有重要的生理意義，臨床上導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的最常見原因是抗生素的使用。近年來我國各級醫(yī)療機構(gòu)的抗生素濫用現(xiàn)象十分普遍，因而腸道菌群失調(diào)就變得較為常見。人類流行病學(xué)調(diào)查表明在嬰幼兒時期有抗生素暴露史者則以后發(fā)生哮喘的危險性增高，相關(guān)動物實驗也提示抗生素所致腸道菌

2、群失調(diào)與變應(yīng)性疾病的發(fā)生相關(guān)。
　　 Th17細胞是繼Th1、Th2之后新近發(fā)現(xiàn)的第三類效應(yīng)性T細胞，無論臨床研究還是動物實驗，大量結(jié)果均提示Th17在哮喘發(fā)生中起到重要作用。近年來，免疫細胞的效應(yīng)一調(diào)節(jié)功能失衡亦成為過敏性疾病研究中的重要內(nèi)容，調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）亞群的調(diào)節(jié)功能不足，可能是哮喘等變應(yīng)性疾病發(fā)生的重要機制。此外，樹突細胞（DC）在機體免疫系統(tǒng)中處于中心地位。作為一種專職抗原提呈細胞，DC可經(jīng)其膜表面的Toll

3、樣受體（TLR）等來識別各種微生物的病原相關(guān)分子模式（PAMP），通過提呈抗原和分泌相應(yīng)細胞因子，進而在指導(dǎo)Th0細胞分化為Th1、Th2、Th17、Treg細胞的過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 在前期研究基礎(chǔ)之上，我們擬采用卵清蛋白（OVA）霧化吸入氣道激發(fā)，以進一步證實Th2優(yōu)勢反應(yīng)的發(fā)生；明確在腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)過程中是否存在著Th1/Th2/Th17/Treg平衡的失調(diào)；并在腸道菌群失調(diào)狀態(tài)下觀察肺組織中樹突細胞（

4、DC）功能狀態(tài)的變化情況。本研究結(jié)果將進一步闡明T細胞亞群尤其是Th17/Treg平衡以及樹突細胞在腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)發(fā)生過程中的作用，可為哮喘等變應(yīng)性疾病的防治提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 第一部分、卵清蛋白霧化吸入誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)小鼠肺部過敏反應(yīng)的發(fā)生
　　 目的：在抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠模型基礎(chǔ)上采用卵清蛋白（OVA）直接霧化吸入激發(fā)，探討氣道變應(yīng)性反應(yīng)與腸道菌群失調(diào)的關(guān)系，以期為后續(xù)實驗打下良好的動

5、物模型基礎(chǔ)。
　　 方法：將112只雌性BALB/c小鼠隨機分為兩批6組，第一批：菌群失調(diào)Ⅰ組、對照Ⅰ組；第二批：菌群失調(diào)Ⅱ組、菌群失調(diào)加激發(fā)組、激發(fā)組、對照Ⅱ組。前2組和后4組小鼠分別于造模第6天和第14天時取盲腸內(nèi)容物做腸道細菌培養(yǎng)計數(shù)。后4組小鼠在第14天時還要對其支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行細胞分類計數(shù)，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化情況，采用流式細胞術(shù)檢測肺組織中Th1及Th2細胞水平，并用ELISA法檢測BALF和血

6、清中OVA特異性IgE的水平。
　　 結(jié)果：與對照Ⅰ組比較，自由飲用抗生素的小鼠出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，第6天時腸道細菌培養(yǎng)未見明顯菌落生長，在第14天時腸道菌群失調(diào)仍未恢復(fù)正常。菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠支氣管肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、淋巴細胞、嗜酸粒細胞和中性粒細胞均增加，肺部出現(xiàn)以嗜酸粒細胞和淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，肺組織黏液分泌明顯增高，BALF中OVA特異性IgE水平顯著增高，肺部Th2細胞水平增高，Th1細胞水平與對照Ⅱ組無差異

7、，但Th1/Th2比值降低。
　　 結(jié)論：抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)過卵清蛋白霧化吸入激發(fā)后，可產(chǎn)生Th2細胞占優(yōu)勢的變應(yīng)性氣道反應(yīng)，提示抗生素所致腸道菌群失調(diào)可能是誘發(fā)哮喘等變應(yīng)性疾病的危險因素之一。
　　 第二部分、卵清蛋白氣道激發(fā)對腸道菌群失調(diào)小鼠T細胞功能亞群的影響
　　 目的：觀察抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)OVA氣道激發(fā)后，肺組織和脾臟中T淋巴細胞功能亞群（Th1/Th2/Th17/treg）之間的

8、相互變化，進一步探討腸道菌群失調(diào)致肺部過敏反應(yīng)發(fā)生這一現(xiàn)象在T細胞水平的作用機制。
　　 方法：將96只雌性BALB/c小鼠隨機分為4組，菌群失調(diào)組、菌群失調(diào)加激發(fā)組、激發(fā)組、對照組，每組24只。于實驗第14天時用ELISA法檢測BALF中細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10的水平，用RT-PCR法檢測肺組織中特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3兩者的mRNA表達水平，并采用流式細胞術(shù)檢測肺組織及脾臟中Th1、T

9、h2、Th17以及CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平。
　　 結(jié)果：菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠BMLF中IL-4和IL-17水平增高，而IFN-γ和IL-10水平在各組間比較均無差異。菌群失調(diào)組及菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中RORγt mRNA表達增加，而Foxp3 mRNA表達降低。菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中Th1細胞水平無變化，而Th2、Th17細胞水平均增高；脾臟中Th1、Th2、Th17細胞水平均與對照組無差異。此

10、外，菌群失調(diào)組及菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織及脾臟中Treg水平均降低。
　　 結(jié)論：抗生素所致腸道菌群失調(diào)小鼠經(jīng)OVA霧化吸入激發(fā)后，肺部免疫狀態(tài)在mRNA水平發(fā)生了潛在性改變，此外還可產(chǎn)生。Th2、Th17細胞均占優(yōu)勢的變應(yīng)性氣道反應(yīng)，這可能與Treg細胞的產(chǎn)生數(shù)量減少以及調(diào)節(jié)功能不足有關(guān)。
　　 第三部分、腸道菌群失調(diào)小鼠樹突細胞功能狀態(tài)變化對肺部過敏反應(yīng)的影響
　　 目的：觀察抗生素所致腸道菌群失調(diào)對小鼠肺

11、組織中樹突細胞（DC）成熟度和Toll樣受體2、4的影響，以深入探討OVA氣道激發(fā)引起肺部發(fā)生過敏反應(yīng)在抗原提呈細胞水平的作用機制。
　　 方法：將64只雌性BALB/c小鼠隨機分為4組，菌群失調(diào)組、菌群失調(diào)加激發(fā)組、激發(fā)組、對照組，每組16只。于實驗第14天時用流式細胞術(shù)檢測肺組織中樹突細胞亞型和成熟度（MHC-Ⅱ類分子）及其膜表面Toll樣受體2、4的表達水平，采用免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中TGF-β1、IL-6蛋白的原位表

12、達情況，并用ELISA法檢測BALF中TGF-β1、IL-6的產(chǎn)生水平。
　　 結(jié)果：與對照組和激發(fā)組比較，菌群失調(diào)組及菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中樹突細胞膜表面MHC-Ⅱ類分子及TLR2、4的表達均增加，但其在后兩組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與其它3組比較，菌群失調(diào)加激發(fā)組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6蛋白的原位表達增高，且BALF中TGF-β1、IL-6水平亦同步增加。
　　 結(jié)論：腸道菌群失調(diào)使得肺部樹突細胞的