薏苡炭疽病的鑒定及一氧化氮在植物抗病性中作用的研究.pdf

1、炭疽病是一類發(fā)生普遍、經(jīng)濟(jì)上十分重要的植物病害。對(duì)炭疽菌抗性的研究可為該病害的控制提供理論依據(jù)。植物抗病性有多種表現(xiàn)形式，非寄主抗性和抗病基因決定的基因?qū)蚩剐允瞧渲兄匾膬煞N。本論文研究鑒定了一種薏苡新病害——薏苡炭疽?。环治隽怂緦?duì)膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的非寄主抗性及其生理機(jī)制，研究了一氧化氮(nitricoxide，NO)在非寄主抗性和基因?qū)蚩剐灾械目赡茏饔?。取得以下結(jié)果：

2、 1.鑒定了一種薏苡新病害。該病害的發(fā)病特點(diǎn)是：薏苡植株葉片和莖稈受其危害先呈水漬狀褐色小斑點(diǎn)，后沿脈迅速擴(kuò)展成橢圓形至梭形病斑。病斑最大可達(dá)6-8×2-4cm，外緣褐色，中部凹陷灰色。后期在病斑中部形成許多小黑點(diǎn)。莖稈多個(gè)病斑擴(kuò)展后?；ハ嘟舆B愈合導(dǎo)致植株易折斷倒伏，嚴(yán)重降低種子的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過(guò)微生物分離培養(yǎng)、薏苡植株回接、以及發(fā)病植株上病原物的再分離培養(yǎng)等步驟，完成Koch氏法則循環(huán)，鑒定并獲取該薏苡病害病原物。 該病

3、原物形成分生孢子盤，周圍生有褐色剛毛，具2-3個(gè)分隔，分生孢子單細(xì)胞、無(wú)色、鐮刀形，中間有一油球。分生孢子長(zhǎng)約20μm，寬約3-5μm。附著胞橢圓至圓形。產(chǎn)生菌核。形態(tài)特征和寄主范圍等與現(xiàn)己明確的寄生禾本科植物的四種炭疽菌有差異。 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得一個(gè)565bp的rDNA序列，GeneBank登錄號(hào)為DQ539441。BLAST搜索結(jié)果表明該菌與寄生于禾本科植物的炭疽菌C.caudatum的親緣關(guān)系最近，但二者ITS1序列差異

4、顯著，共183bp序列中有25個(gè)堿基不同，然而二者160bpITS2序列僅有4個(gè)堿基不同。 形態(tài)學(xué)和ITS序列分析結(jié)果表明，導(dǎo)致薏苡病害的病原物是一種炭疽菌，薏苡是新發(fā)現(xiàn)的炭疽菌寄主。該病原物種的分類地位有待進(jìn)一步研究。 2.分析了水稻對(duì)膠孢炭疽菌的非寄主抗性及其生理機(jī)制。水稻是膠孢炭疽菌辣椒分離物的非寄主，以該菌分生孢子懸浮液接種后，水稻未表現(xiàn)任何肉眼可見的癥狀。接種到水稻葉面的膠孢炭疽菌分生孢子能夠正常萌發(fā)，形成芽管

5、并產(chǎn)生附著胞，附著胞有黑色素沉積，但是沒(méi)有觀察到細(xì)胞內(nèi)菌絲的生長(zhǎng)。連接分生孢子和附著胞的芽管長(zhǎng)度很長(zhǎng)，達(dá)120～130μm，是在寄主辣椒表面的3倍左右。而且，膠孢炭疽菌在水稻葉表形成的附著胞大多有不同的變形如外緣凹陷等，且出現(xiàn)同一根芽管上生成兩個(gè)附著胞的情況。而在寄主表面的附著胞呈規(guī)則的橢圓形，一個(gè)芽管只在頂端形成一個(gè)附著胞。 分析了NO在“水稻—膠孢炭疽菌”互作體系中的時(shí)序變化。研究發(fā)現(xiàn)以炭疽菌和稻瘟菌接種后NO含量均產(chǎn)生一個(gè)

6、明顯的高峰，但是不同菌接種后產(chǎn)生NO最高峰的時(shí)間以及強(qiáng)度均不相同。非寄主水稻植株體內(nèi)NO在炭疽菌接種后4h即顯著升高，此后持續(xù)增加，至接種后36h達(dá)到最高值1.15mg/Kg鮮重，為清水處理對(duì)照的2.2倍，此后急劇下降，至48h與CK水平相當(dāng)，此后維持在與CK相當(dāng)?shù)乃?。非親和互作的稻瘟菌(217F1)接種后NO最高值出現(xiàn)在接種后60h，達(dá)1.08mg/Kg鮮重，為CK的1.9倍。而致病性稻瘟菌(220E3)與水稻、膠孢炭疽菌與辣椒的親

7、和互作，接種后NO最高值均出現(xiàn)在接種后96h，為0.95mg/Kg左右，為CK的1.9倍。 3.采用基因沉默技術(shù)分析了一氧化氮合酶(NOsynthase，NOS)在本氏煙對(duì)煙草脆裂病毒(TRV)的抗性和Cf4介導(dǎo)的HR中的作用。克隆了煙草和番茄NOS1cDNA片段(GenBank登錄號(hào)：煙草NtNOS1，DQ539435；番茄LeNOS1，DQ539436)。將NtNOS1克隆至TRV基因沉默載體pYL156，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基

8、因沉默分析。研究發(fā)現(xiàn)，NOS1基因沉默植株表現(xiàn)明顯的TRV病毒癥狀，而且這些癥狀的嚴(yán)重程度與農(nóng)桿菌的接種方法密切相關(guān)。嚴(yán)重的在接種后3-4周，植株全株變褐枯死。而非沉默對(duì)照植株則不表現(xiàn)明顯癥狀。RealTime-PCR分析表明，NOS1基因沉默植株體內(nèi)TRV病毒積累量顯著增高，最高時(shí)為非沉默對(duì)照植株的4.1倍。說(shuō)明NOS1可能在對(duì)TRV的抗性中起重要作用。 NOS1基因沉默后的本氏煙葉片用分別含有Cf-4和Avr4的農(nóng)桿菌1∶1