CD147在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中性粒細(xì)胞中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、【目的】
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種以滑膜增殖和骨質(zhì)破壞為主要特征的慢性炎性疾病。目前認(rèn)為成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-likesynovialcell,FLS）在空間占位的同時(shí)，也可以通過(guò)分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）達(dá)到破壞軟骨的目的。在RA關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在大量的炎細(xì)胞，其中滑液中含量最豐富的細(xì)胞是中性粒細(xì)胞，它的代謝產(chǎn)

2、物水平可以作為反映病情活動(dòng)度的指標(biāo)之一。CD147分子，是一種分子量約在57KD左右的跨膜糖蛋白，因其在促進(jìn)MMPs分泌中具有重要意義，也被稱為胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)在RA滑膜細(xì)胞表面CD147分子高表達(dá)，促進(jìn)其MMPs的分泌和活化，同時(shí)增強(qiáng)侵襲能力。但是，在細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用中如何促進(jìn)MMPs分泌增加的機(jī)制尚

3、不清楚。為了觀察CD147分子在中性粒細(xì)胞表面的表達(dá)水平及其功能，我們進(jìn)行了以下研究。
　　【方法】
　　采用FACS流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD147表達(dá)陽(yáng)性率及平均熒光強(qiáng)度（meanfluorescenceintensity,MFI），CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用實(shí)時(shí)-定量PCR技術(shù)測(cè)定MMP-1，-2，-3，-9和CD147的mRNA表達(dá)量，MxProQPCR軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用改良的48孔Boyden小室

4、進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)，親環(huán)素A（cyclophilinA,CyPA）做趨化劑，同時(shí)在細(xì)胞中加入抗CD147單抗觀察其阻斷效果。采用明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中MMP-2和MMP-9的表達(dá)及活化情況。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）測(cè)定MMP-1和MMP-3的表達(dá)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)使用Boyden小室進(jìn)行。采用激光共聚焦掃描顯微鏡測(cè)定HL-60細(xì)胞中游離Ca2+濃度，粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞與

5、胞外基質(zhì)的粘附能力，并用westernblot方法檢測(cè)脂筏中TRPM-7的表達(dá)變化情況。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次。采用Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　【結(jié)果】
　　1．CD147在RA滑膜細(xì)胞表面陽(yáng)性表達(dá)率高于骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）滑膜細(xì)胞對(duì)照組。HL-60細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后CD147表達(dá)的MFI量顯著增加。自RA外周血中分離的中性粒細(xì)胞CD147表達(dá)的MFI量較自健

6、康對(duì)照者外周血中分離的中性粒細(xì)胞表達(dá)高。自RA滑液中分離的中性粒細(xì)胞CD147表達(dá)的MFI量較自RA外周血中分離的中性粒細(xì)胞顯著增高。
　　2．RA滑膜細(xì)胞中MMP-1，-2，-3，-9和CD147的mRNA表達(dá)量較OA對(duì)照組顯著增加，與HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)后增加明顯。HL-60細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后MMP-1，-2，-3，-9和CD147的mRNA表達(dá)量均較誘導(dǎo)分化前增加。
　　3．由CyPA介導(dǎo)的趨化作用在誘導(dǎo)分化后HL-60

7、細(xì)胞中較誘導(dǎo)分化前增加明顯。在加入抗CD147抗體組中趨化數(shù)目降低明顯。
　　4．明膠酶譜和ELISA結(jié)果均顯示RAFLS中MMPs的表達(dá)量較OAFLS對(duì)照組顯著增加。誘導(dǎo)分化后的HL-60細(xì)胞較誘導(dǎo)分化前顯著增加。RAFLS與誘導(dǎo)分化后的HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)后的MMPs表達(dá)量較與誘導(dǎo)分化前共培養(yǎng)組顯著增加。經(jīng)抗CD147抗體作用后，MMPs表達(dá)量顯著降低，無(wú)關(guān)抗體對(duì)照組則無(wú)顯著變化。
　　5．明膠酶譜和ELISA結(jié)果顯示R

8、AFLS與RA外周血中性粒細(xì)胞或健康對(duì)照者外周血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后，MMPs表達(dá)量均較RAFLS單獨(dú)培養(yǎng)組顯著增加；且與RA外周血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組增加更明顯。加入抗CD147單抗后MMPs表達(dá)量降低明顯，無(wú)關(guān)單抗組中無(wú)此現(xiàn)象。
　　6．RAFLS與RA滑液中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后MMPs表達(dá)量較RAFLS單獨(dú)培養(yǎng)組或其與RA外周血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組增加，加入CD147單抗后MMPs表達(dá)量顯著降低，無(wú)關(guān)單抗組則無(wú)此作用。
　　7．

9、侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAFLS侵襲數(shù)目較OAFLS對(duì)照組顯著增加，與誘導(dǎo)分化后HL-60共培養(yǎng)后侵襲數(shù)目較誘導(dǎo)分化前顯著增加，且均較RAFLS單獨(dú)培養(yǎng)組增加明顯。RAFLS與RA外周血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后較與健康對(duì)照者外周血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，侵襲數(shù)目顯著增加。RAFLS與RA滑液中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后較與RA外周血中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，侵襲數(shù)目顯著增加。加入CD147單抗后侵襲數(shù)目顯著降低，無(wú)關(guān)單抗組則無(wú)此作用。
　　8．胞內(nèi)鈣離子測(cè)定

10、及粘附實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)CyPA刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞粘附能力顯著增加，加入CD147單抗后這種作用被阻斷，Westernblot結(jié)果提示可能與脂筏層中TRPM-7蛋白發(fā)揮功能有關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1．本研究發(fā)現(xiàn)CD147表達(dá)量在HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化后顯著增加。明膠酶譜及ELISA檢測(cè)顯示分化成熟后的HL-60細(xì)胞MMPs表達(dá)量顯著增加。在細(xì)胞分化過(guò)程中檢測(cè)到的CD147高表達(dá)與MMPs高表達(dá)相關(guān)，由此導(dǎo)致的MMPs及

11、其抑制因子之間的失衡可能導(dǎo)致了RA的關(guān)節(jié)破壞。
　　2．為了觀察細(xì)胞間相互作用在MMPs產(chǎn)生及RAFLS侵襲中的作用，我們將RAFLS與HL-60細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)。明膠酶譜和ELISA實(shí)驗(yàn)均證實(shí)RAFLS經(jīng)與HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)后，較各自單獨(dú)培養(yǎng)組MMPs表達(dá)量顯著增加。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)也證實(shí)高表達(dá)CD147的中性粒細(xì)胞可能通過(guò)與RAFLS相互作用在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
　　3．為了模擬RA患者體內(nèi)最真實(shí)情況，我們自RA外周

12、血及滑液中分離了中性粒細(xì)胞，與RAFLS進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果與RAFLS及HL-60細(xì)胞共培養(yǎng)體系有類似的趨勢(shì)，提示在體內(nèi)高表達(dá)的CD147發(fā)揮了促進(jìn)MMPs產(chǎn)生的作用，同時(shí)可以增強(qiáng)RAFLS的侵襲能力。
　　4．CD147單抗可以顯著抑制MMPs的產(chǎn)生及RAFLS的侵襲能力，提示阻斷CD147后，MMPs的產(chǎn)生及RAFLS的侵襲能力均被抑制。
　　5．趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí)CyPA對(duì)中性粒細(xì)胞有顯著的趨化作用，這種趨化作用可以被CD14

13、7單抗所阻斷，提示CyPA可能作為CD147的配體在高表達(dá)CD147的炎細(xì)胞募集過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　6．CD147分子可能通過(guò)TRPM-7蛋白參與了由CyPA誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，CD147抗體可將其阻斷。
　　7．總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)了在RA中性粒細(xì)胞高表達(dá)的CD147分子可能與CyPA介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化，RAFLS的MMPs分泌及其侵襲能力有關(guān)，上述功能均與RA軟骨侵襲及骨質(zhì)破壞