趨化因子受體CXCR7在肝內膽管癌生長轉移中的作用及其機制.pdf

1、研究背景：
　　肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma.ICC)是指左右肝管匯合部以上的膽管上皮細胞起源的惡性腫瘤，其惡性程度高、癥狀隱匿，預后差。肝內膽管癌預后差的主要原因是該病發(fā)展迅速，容易發(fā)生肝內轉移、周圍臟器侵犯、淋巴轉移以及遠處器官轉移，因此研究肝內膽管癌生長轉移的相關機制，對肝內膽管癌預防和治療具有重要意義。近來研究發(fā)現多腫瘤細胞高表達趨化因子受體CXCR7，高表達CXCR7的腫瘤細

2、胞惡性度更高、侵襲力更強，更容易引起轉移。
　　目前CXCR7在肝內膽管癌中的表達情況和在肝內膽管癌的生長轉移過程中所起的作用及其機制尚未見報道。本課題研究探討CXCR7在肝內膽管癌組織中的表達及其與肝內膽管癌臨床病理因素和預后的關系；分別采用慢病毒載體上調CXCR7基因表達以及shRNA干擾技術沉默CXCR7基因表達等方法，研究CXCR7對肝內膽管癌細胞增殖、侵襲和轉移等功能的影響；并且在裸鼠皮下及肝臟原位模型上研究CXCR7對

3、肝內膽管癌生長和侵襲轉移的影響，以尋求肝內膽管癌治療的可能的新途徑。本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 CXCR7在肝內膽管癌組織中的表達及其臨床意義
　　目的：本部分研究檢測CXCR7在肝內膽管癌組織中的表達，研究其與CXCR4、CXCL12表達的相關性及與臨床病理因素間的關系及其對肝內膽管癌預后的影響。
　　方法：應用免疫組織化學法檢測81例肝內膽管癌組織標本及癌旁肝組織標本中CXCR7表達情況，結合臨床

4、資料進行分析，CXCR7表達陽性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，CXCR7在肝內膽管癌組織中的表達與臨床病理因素的相關性采用χ2檢驗。
　　結果：CXCR7在肝內膽管癌組織中高表達，大部分為胞漿染色，陽性率為66.7％，CXCR7在癌旁正常肝組織中幾乎不表達（P＜0.01）。CXCR7的表達與CXCR4、CXCL12的表達相關；肝內膽管癌臨床病理

5、因素的關系分析顯示，CXCR7的表達與腫瘤分化程度、TNM分期密切相關，Ⅲ期和Ⅳ期者 CXCR7表達明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期者，差異具有統計學意義（P＜0.01）；CXCR7表達在低分化肝內膽管癌中明顯高于高分化膽管癌，差異具有統計學意義（P＜0.01）。CXCR7陽性組1年，3年，5年生存率為46.5%，0%，0%，中位生存時間為12個月；CXCR7陰性組1年，3年，5年生存率為88.2%，54%，10.8%，中位生存時間為48個月；生存分

6、析表明 CXCR7陽性患者術后生存期明顯短于CXCR7陰性患者，差異具有統計學意義（P＜0.001），多因素分析表明CXCR7表達水平是影響肝內膽管癌患者手術后生存的獨立因素。
　　第二部分 人肝內膽管癌細胞株CXCR7基因的表達，及CXCR7高/低表達株的構建
　　目的：檢測肝內膽管癌細胞株CXCR7的表達；構建高表達CXCR7的肝內膽管癌細胞株；沉默高表達CXCR7的肝內膽管癌細胞株的基因表達，為后續(xù)試驗進一步研究CXC

7、R7基因對肝內膽管癌細胞產生的影響提供基礎。
　　方法：應用Real Time-PCR，Western-blot檢測人肝內膽管癌細胞RBE和HCCC的CXCR7mRNA及其蛋白的表達。通過構建慢病毒CXCR7表達載體，上調低表達CXCR7的肝內膽管癌細胞株CXCR7的表達；再通過慢病毒shRNA載體靶向干擾沉默高表達CXCR7的肝內膽管癌細胞株CXCR7的表達。
　　結果：肝內膽管癌細胞株RBE有表達CXCR7mRNA及蛋白

8、；HCCC表達CXCR7mRNA量較低，不表達CXCR7蛋白。慢病毒CXCR7載體感染肝內膽管癌細胞株HCCC有效上調CXCR7 mRNA及其蛋白的表達（P＜0.01）。以慢病毒為載體shRNA基因干擾能特異性抑制人肝內膽管癌細胞株RBE的CXCR7 mRNA及其蛋白的表達（P＜0.01）。
　　第三部分 CXCR7基因對人肝內膽管癌細胞增殖、粘附、侵襲及轉移能力的影響
　　目的：CXCR7基因對人肝內膽管癌細胞增殖、粘附、

9、侵襲、及轉移能力的影響。
　　方法：肝內膽管癌細胞 RBE分為三組：RBE、陰性對照組 RBE-NCshRNA及干擾組RBE-CXCR7shRNA,肝內膽管癌細胞HCCC分為三組：HCCC、陰性對照組HCCC-LV及上調組HCCC-CXCR7。應用CXCR7的配體CXCL12作用于各組細胞，CCK-8法檢測各組細胞增殖能力；Transwell小室運動侵襲試驗檢測細胞遷移和侵襲能力；檢測各組細胞的黏附能力；明膠酶譜法檢測各組細胞MM

10、P2分泌。CXCR7小分子抑制劑CCX733與各組細胞孵育，再分別檢測各組細胞的功能。
　　結果：CXCL12刺激增強肝內膽管癌細胞RBE增殖能力，對肝內膽管癌細胞HCCC增殖能力沒有影響，上調CXCR7表達可增強肝內膽管癌細胞株HCCC的增殖能力（P＜0.01）。CXCL12/CXCR7增強肝內膽管癌細胞RBE細胞的遷移運動、侵襲、粘附和分泌MMP2能力（P＜0.01），這些功能在shRNA干擾沉默 CXCR7基因后明顯受到抑制

11、（P＜0.01），CXCR7小分子抑制劑CCX733也抑制這些細胞功能（P＜0.01）；上調CXCR7表達增強肝內膽管癌細胞株HCCC的遷移運動、侵襲、粘附和分泌MMP2能力（P＜0.01）。
　　第四部分 CXCR7基因對人肝內膽管癌細胞裸鼠移植瘤生長轉移能力的影響
　　目的：了解CXCR7基因對人肝內膽管癌細胞裸鼠移植瘤生長轉移能力的影響。
　　方法：建立裸鼠皮下肝內膽管癌模型，15只裸鼠，隨機分為3組，每組5只，

12、分別將對數生長期 HCCC細胞，陰性對照細胞株 HCCC和上調組HCCC-CXCR7細胞株，注入實驗裸鼠右前腋皮下。觀察4w，每周兩次測量腫瘤體積，繪制生長曲線，4w解剖腫瘤，測量體積稱重，病理切片檢查，免疫組化檢測CXCR7的表達。建立裸鼠肝臟原位肝內膽管癌模型，裸鼠15只，隨機分為3組，每組5只，裸鼠麻醉開腹后將分別將對數生長期HCCC、HCCC-CXCR7和HCCC-LV細胞注入左肝，術后28d后處死裸鼠，觀察腹水以及肝臟及腹腔轉

13、移情況，切取原位癌，稱重后，標本病理檢查和免疫組化檢測。
　　結果：皮下模型CXCR7表達上調組（HCCC-CXCR7）細胞6d后可見皮下腫瘤形成，腫瘤增長較快，到28d時已明顯增大，成瘤率為100%；空白對照組（HCCC）9d后可見皮下腫瘤形成，腫瘤生長緩慢，成瘤率為80%；陰性對照組（HCCC-LV）10d后可見皮下腫瘤形成，腫瘤生長緩慢，成瘤率為80%；根據腫瘤大小繪制腫瘤生長曲線，HCCC-CXCR7組腫瘤生長速度明顯快于

14、其他兩組(P＜O.01)，其他兩組差別不大(P＞0.05)；腫瘤體積和重量測量結果顯示，HCCC-CXCR7組明顯大于陰性對照組和空白對照組(P＜O.01)，陰性對照組和空白對照組比較差異無顯著意義(P＞0.05)。原位接種肝內膽管癌細胞HCCC28d后解剖裸鼠，成瘤率為100%；空白對照組和陰性對照組可出現腫瘤，腫瘤生長較緩慢，少數可出現肝內轉移；CXCR7表達上調可促進裸鼠人肝內膽管癌細胞 HCCC-CXCR7原位移植瘤的生長，并且

15、促進腫瘤肝內轉移、腹腔內種植轉移和淋巴轉移(P＜O.01)。
　　結論：
　　1、肝內膽管癌組織中異常高表達趨化因子受體CXCR7；CXCR7的表達與CXCR4、CXCL12的表達相關；CXCR7的表達與肝內膽管癌分化、分期、血行轉移、神經侵犯和淋巴結轉移密切相關；CXCR7表達陽性的肝內膽管癌患者術后生存時間明顯小于CXCR7陰性患者，CXCR7是影響肝內膽管癌患者術后生存的獨立危險因素。
　　2、肝內膽管癌細胞株R

16、BE表達CXCR7mRNA及蛋白；肝內膽管癌細胞株HCCC表達CXCR7mRNA量較低，不表達CXCR7蛋白。以慢病毒為載體CXCR7-LV感染HCCC有效上調CXCR7 mRNA及其蛋白的表達。以慢病毒為載體shRNA基因干擾能特異性抑制RBE的CXCR7 mRNA及其蛋白的表達。
　　3、CXCL12/CXCR7可增強肝內膽管癌細胞的增殖、遷移運動、侵襲、粘附和分泌MMP2能力，這些功能在shRNA干擾沉默CXCR7基因后明顯