衣霉素誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的胃癌BGC823細胞凋亡.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊、聚集的場所,也是調(diào)節(jié)和貯存細胞鈣水平的重要場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是由于未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)累積或內(nèi)環(huán)境的Ca2+濃度的改變導致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構和功能的失衡引起的。
　　在這種情況下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的反應以特定蛋白質(zhì)的改變?yōu)樘卣?翻譯速率的下調(diào);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的表達上調(diào);錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解。一般情況下,這一系列反應能成功恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)環(huán)境平衡

2、。但是,在多細胞動物里,持久或者強烈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會導致細胞凋亡。缺氧和未正確折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及胞漿Ca2+失衡均可以導致其紊亂,從而誘發(fā)一系列相關蛋白質(zhì)表達和細胞表型改變,稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對決定應激細胞的結(jié)局如抵抗、適應、損傷或凋亡有重要作用。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔形成空間結(jié)構由許多分子伴侶蛋白協(xié)助,其中最主要的是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)GRP家族的GRP78/BIP,對細胞起保護作用,恢復蛋白質(zhì)正確構像;同時,轉(zhuǎn)錄

3、因子ATF6及跨膜蛋白激酶PEKR的活化可誘發(fā)一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。其中GADD153/CHOP基因的編碼蛋白可降低Bcl-2表達、使細胞谷胱甘肽耗竭引起細胞凋亡。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應時間過長或強烈,還將活化定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的半胱天冬酶-12,繼而引起半胱天冬酶級聯(lián)反應,導致細胞凋亡。CHOP是作為一個C/EBPs(CCAAT/enhancer binding proteins)被發(fā)現(xiàn)的,也叫生長停滯和DNA損傷誘導基因1

4、53即GADD153(growth arrest and DNAdamage-153),分子量約為27kDa,在人類有169個氨基酸殘基,在嚙齒類動物有168個氨基酸殘基,GADD基因是有遺傳毒性應激和生長停滯信號誘導的一組基因。有三個不同的GADD基因,但是他們之間又沒有相似性。C/EBPs組成一個轉(zhuǎn)錄蛋白家族,與其他蛋白質(zhì)因子一起組成復雜精細的調(diào)控網(wǎng)絡,在細胞增殖、分化、信號傳導、腫瘤發(fā)生以及機體的免疫、應激反應、能量代謝、血液生成

5、等方面發(fā)揮重要作用。正常情況下,凋亡促進因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白CHOP(C/EBP-homologous protein)即C/EBP同源蛋白表達量十分低。但是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的情況下,表達量則顯著增加。所以CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的一個金標準。國內(nèi)外研究證明了TM在神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺細胞等中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡。但尚未見到在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的胃癌細胞凋亡的相關報道。我們用10μg/ml的TM分別以不同的時間胃癌BGC823細胞,

6、從基因水平和蛋白表達水平檢測TM誘導胃癌BGC823細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡,從而證明TM能否誘導胃癌BGC823細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡。
　　方法:
　　(1)體外培養(yǎng)胃癌BGC823細胞,在生長對數(shù)期用10μg/ml的TM分別處理0h、24h、36h、48h誘導胃癌BGC823細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。
　　(2)活體培養(yǎng)觀察細胞生長狀態(tài)的變化、Annexin V-PI染色法檢測凋亡觀察胃癌BGC823表面形態(tài)的變

7、化了解TM的誘導細胞凋亡的作用。
　　(3)分別于0h、24h、36h和48h終止作用,RT-PCR技術檢測TM作用前后CHOP-mRNA表達的變化。
　　(4)應用Western blot技術檢測CHOP蛋白在TM誘導前后表達水平的變化,從蛋白水平反映CHOP與誘導胃癌BGC823細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡的關系。
　　(5)所得結(jié)果運用SPSS統(tǒng)計軟件包處理,統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((?)±s)表示。以α=0.

8、05為顯著性檢驗標準。
　　結(jié)果:
　　(1)TM作用后,胃癌BGC823細胞生長狀態(tài)呈細胞密度和聚集程度均下降,幾個細胞散在生長多見,細胞體積縮小變圓且胞間距增大,細胞大小相差懸殊不大,胞質(zhì)顆粒感增強,胞膜出芽脫落成大小不等的凋亡小體等改變。
　　(2)Annexin V-PI染色法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,TM作用后,熒光顯微鏡下示綠色熒光細胞為凋亡細胞,紅色熒光細胞為死亡細胞。隨著處理時間的增加,凋亡細胞也增多。

9、r>　　(3)TM誘導胃癌BGC823細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導凋亡得過程中出現(xiàn)了CHOP的表達,且CHOP-mRNA表達水平存在時間依賴性。在一定得條件下,隨著處理時間增長,表達量也增加。
　　(4)Western-blot結(jié)果顯示TM誘導胃癌BGC823細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導凋亡得過程中出現(xiàn)了CHOP的表達,且CHOP蛋白水平表達存在時間依賴性。在一定得條件下,隨著處理時間增長,表達量也增加。
　　結(jié)論:
　　TM可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)