蛋白酶活化受體-1單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、背景與目的:蛋白酶活化受體-1(PAR-1)是一種的蛋白質(zhì),由425個(gè)氨基酸組成,含7個(gè)疏水跨膜域,為典型的G蛋白偶聯(lián)受體。PAR-1廣泛分布在各種組織細(xì)胞上,包括上皮細(xì)胞,血小板,內(nèi)皮細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,單核細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞,成骨細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及某些癌細(xì)胞系等。PAR-1具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),參與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展,因此,我們制備廉價(jià)、有效的抗PAR-1mAb具有重要意義。
　　方法:以PAR-1特異性片

2、段為免疫原(13肽)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤NS-1細(xì)胞融合。通過(guò)間接ELISA法篩選可特異性分泌抗PAR-1 mAb的雜交瘤細(xì)胞。采用capture ELISA法鑒定mAb的Ig亞類(lèi);通過(guò)ELISA、Dot blot、免疫組織化學(xué)染色法、流式細(xì)胞分析、激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)鑒定mAb的特異性。
　　結(jié)果:獲得2株可穩(wěn)定分泌抗PAR-1 mAb的雜交瘤細(xì)胞,其亞型分別為IgM,IgG2b。Dot blo

3、t檢驗(yàn)表明,mAbs可與膜上的抗原結(jié)合。免疫組織化學(xué)染色表明,mAb與人扁桃體、結(jié)腸組織中的淋巴細(xì)胞、包皮組織中的成纖維細(xì)胞、肺組織中的巨噬細(xì)胞反應(yīng)呈陽(yáng)性。流式細(xì)胞儀分析顯示,2株mAb與人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞膜上及細(xì)胞胞漿內(nèi)的受體均呈陽(yáng)性反應(yīng)。激光共聚焦掃描顯微鏡觀(guān)察,A549細(xì)胞的胞膜及胞漿內(nèi)均有熒光標(biāo)記的陽(yáng)性反應(yīng)物。
　　結(jié)論:成功地制備抗PAR-1 mAb,為變態(tài)反應(yīng)性疾病,炎癥性疾病及其他疾病的研究工作提供了有用的試