抵抗素對人肝細胞株HepG2細胞糖脂代謝的影響及其機制探討.pdf

1、肥胖與2型糖尿病關(guān)系密切，其共同的病理生理特征是：胰島素抵抗(InsulinResistance，IR)。但肥胖如何導致IR，從而引起2型糖尿病的發(fā)生？其根本機制尚未完全明了。 脂肪組織可釋放多種脂肪因子，參與調(diào)節(jié)糖脂代謝和胰島素的敏感性。抵抗素在嚙齒類動物中也是一種脂肪分泌因子，在體內(nèi)的試驗表明輸注抵抗素后能極顯著增加肝糖輸出及損害肝臟胰島素作用，而特異的抵抗素反義寡脫氧核苷酸卻能抑制這種效應(yīng)，其主要機理是通過抑制腺苷酸活化蛋

2、白激酶(AMP—activatedproteinkinase，AMPK)磷酸化，上調(diào)糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖—6-磷酸酶(G6Pase)的表達。抵抗素導致嚙齒類動物胰島素抵抗已得到廣泛認可。 然而，抵抗素在人類的作用還存在爭議，因為人抵抗素同小鼠的抵抗素在氨基酸水平上只有59％的同源性，而且其來源也不同，人抵抗素主要來源于外周血的單核巨噬細胞。有關(guān)人類抵抗素表達水平與肥胖、糖尿病、脂代謝紊亂之間相

3、關(guān)性的在體研究并未得出一致的結(jié)論：部分結(jié)果支持抵抗素與IR相關(guān)，但另外一些結(jié)果顯示抵抗素與IR無關(guān)。目前對人抵抗素的體外研究資料較少，且主要集中在內(nèi)皮細胞及單核巨噬細胞，而對胰島素敏感的靶細胞如肝細胞、脂肪細胞或骨骼肌細胞的代謝是否受人抵抗素影響及其相關(guān)機制的有關(guān)報道更少。 AMPK是細胞內(nèi)總的能量敏感器，是由兩個α亞單位(α1、α2)、兩個β亞單位(β1、β2)和3個γ亞單位(γ1、γ2、γ3)構(gòu)成的異三聚體，其中α亞基起催化

4、作用，β和γ亞基在維持三聚體穩(wěn)定性和作用底物特異性方面起重要作用。AMPK的調(diào)節(jié)主要涉及別構(gòu)調(diào)節(jié)和磷酸化修飾，其中AMPKα亞基172位蘇氨酸的磷酸化是維持其活性所必需，且只有AMPKα2的活性才與胰島素敏感性相關(guān)聯(lián)。AMPK作為機體重要的蛋白激酶，能夠調(diào)節(jié)糖、脂、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝及其相關(guān)基因的表達，是與2型糖尿病密切相關(guān)的主要物質(zhì)。 肝臟胰島素抵抗是2型糖尿病重要病理生理基礎(chǔ)之一。大量的實驗顯示抵抗素在嚙齒類動物可通過抑制A

5、MPK磷酸化導致肝臟IR，本實驗室前期的研究也通過重組腺病毒構(gòu)建高抵抗素血癥的小鼠模型證實了這一點。那么在人類抵抗素是否會損傷肝細胞糖脂代謝，其機制是否也是通過AMPK通路介導？AMPK通路與胰島素信號通路之間的關(guān)系如何？迄今為止有關(guān)報道很少。為此我們對人抵抗素在肝細胞糖脂代謝中的作用及其機制進行了初步探討。 在本課題中我們應(yīng)用重組人抵抗素(以下簡稱人抵抗素)處理人肝細胞株HepG2細胞，同時采用siRNA技術(shù)抑制HepG2細胞

6、AMPKα2的表達，觀察人抵抗素對HepG2細胞糖脂代謝的影響及其作用機制。本課題研究的主要目的在于：①人抵抗素是否對HepG2細胞的葡萄糖代謝產(chǎn)生影響？如果有影響，將進一步闡明其機制是否依賴AMPK途徑。②人抵抗素是否對HepG2細胞的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響？如果有影響，將進一步闡明其機制是否依賴AMPK途徑？③人抵抗素對HepG2細胞胰島素信號通路是否有影響？胰島素信號通路與AMPK通路之間的關(guān)系如何？ 依據(jù)研究目的，本課題研究內(nèi)

7、容主要包括四個部分： 1.采用siRNA技術(shù)抑制AMPKα2在HepG2細胞中的表達。 2.探討人抵抗素對HepG2細胞葡萄糖代謝的影響及其相關(guān)機制。 3.模擬體內(nèi)較高濃度的游離飽和脂肪酸的環(huán)境，探討人抵抗素對HepG2細胞脂質(zhì)代謝的影響及其相關(guān)機制。 4.探討人抵抗素對HepG2細胞胰島素信號通路的影響。 第一部分siRNA抑制HepG2細胞AMPKα2基因的表達研究 目的:利用siRN

8、A技術(shù)抑制HepG2細胞AMPKα2基因的表達 小結(jié):本研究利用化學合成的21nt的AMPKα2siRNA，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，利用反向轉(zhuǎn)染法導入HepG2細胞24h后，AMPKα2mRNA及蛋白表達抑制率分別為52.3±0.8％及48.1±2.3％，可有效地降解AMPKα2mRNA并抑制其蛋白表達，這一作用持續(xù)72小時以上，為進一步研究人抵抗素是否通過AMPK通路影響HepG2細胞的糖脂代謝打下實驗基礎(chǔ)。 第二部分抵抗素

9、對HepG2細胞葡萄糖代謝的影響及其與AMPK通路的關(guān)系 目的:探討人抵抗素對HepG2細胞葡萄糖代謝影響及其與AMPK通路的關(guān)系。 小結(jié)：　　1.人抵抗素在基礎(chǔ)狀態(tài)下以劑量依賴方式降低HepG2細胞AMPK磷酸化水平，在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下降低AMPKα2 mRNA的表達及AMPK磷酸化水平；應(yīng)用AMPKα2 siRNA可使AMPKα2 mRNA的表達及AMPK磷酸化水平進一步降低?！　?.人抵抗素可影響HepG

10、2細胞的葡萄糖代謝：下調(diào)HepG2細胞GLUT—2 mRNA的表達，上調(diào)糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK mRNA表達，并使肝糖原合成減少?！　?.人抵抗素可通過AMPK通路影響HepG2細胞葡萄糖代謝。 第三部分抵抗素對HepG2細胞脂質(zhì)代謝的影響及其與AMPK通路的關(guān)系 目的:探討人抵抗素對HepG2細胞脂肪代謝影響及其與AMPK通路的關(guān)系。 小結(jié)：　　1.在高濃度的游離飽和脂肪酸環(huán)境中，在基礎(chǔ)及胰島

11、素刺激狀態(tài)下人抵抗素可降低HepG2細胞AMPKα2 mRNA的表達及AMPK磷酸化水平；應(yīng)用AMPKα2siRNA可使AMPKα2 mRNA的表達及AMPK磷酸化水平進一步降低?！　?.人抵抗素可影響HepG2細胞的脂質(zhì)代謝：增加胞膜脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36含量，上調(diào)ACC2、SREBP1 mRNA的表達以及降低ACC1(Ser79)蛋白磷酸化水平，使ACC活性增加，下調(diào)肝脂肪酶HL mRNA的表達，并使HepG2細胞內(nèi)脂肪含量增加。

12、　　3.人抵抗素可通過AMPK通路影響HepG2細胞脂質(zhì)代謝。 第四部分抵抗素對HepG2細胞胰島素信號通路的影響 目的:探討人抵抗素對HepG2細胞胰島素PI3K/Akt信號通路的影響及PI3K/Akt通路與AMPK通路與之間的關(guān)系。 小結(jié)：　　1.人抵抗素上調(diào)HepG2細胞SOCS—3 mRNA表達，下調(diào)IRS—2 mRNA表達、減低Akt的蛋白量及降低Akt磷酸化水平。人抵抗素對HepG2細胞胰島素PI