精氨酸對蛋雞采食及組織蛋白質代謝調控的機理研究.pdf

1、本論文研究飼糧添加精氨酸對蛋雞采食及相關因子、蛋白質代謝調控的影響，并在建立雞胚腸上皮細胞模型的基礎上，研究精氨酸對雞胚腸上皮細胞精氨酸轉運、代謝和相關轉運載體及蛋白質合成與相關基因表達水平的影響。結果發(fā)現，精氨酸可影響蛋雞下丘腦（激素）和肝臟（脂肪酸氧化）中調控采食的相關蛋白表達;研究揭示了精氨酸對蛋雞組織（肝臟和小腸）蛋白質代謝相關調控因子基因表達規(guī)律;體外試驗也發(fā)現，精氨酸可以通過提高堿性氨基酸轉運載體-1和誘導性一氧化氮合酶基因

2、表達水平，增加外源精氨酸利用率及一氧化氮的生產量。研究結果，豐富了蛋雞采食理論，為功能性氨基酸在蛋禽組織蛋白質代謝的調控提供了依據。研究結果如下:
　　1蛋雞產蛋期精氨酸需要量的研究
　　本試驗旨在研究國內雜交品種蛋雞（新楊黑）產蛋期精氨酸的需要量。選取31周齡的新楊黑商品代蛋雞864只，隨機分為6組，每組4個重復，每個重復36只雞。蛋雞分別飼喂精氨酸水平為0.64％、0.86％、1.03％、1.27％、1.42％和1.66

3、％的玉米-玉米蛋白粉型飼糧。結果表明:隨著飼糧精氨酸水平的升高，采食量、日產蛋重、產蛋率及料蛋比的變化呈現顯著的二次效應（P＜0.05）;1.27％精氨酸水平組的蛋白高度顯著高于其他各組(P＜0.05)?；诙吻€-折線回歸模型分析，結果提示:以采食量和日產蛋重為評判指標，33-45周齡新楊黑蛋雞精氨酸需要量分別為1.26％和1.28％。
　　2精氨酸對蛋雞采食的調控研究
　　本試驗在飼養(yǎng)試驗的基礎上，研究精氨酸對蛋雞下丘

4、腦NPY、瘦素、血清胃饑餓素、胰島素、一氧化氮含量的影響，同時利用同位素標記相對與絕對定量技術檢測精氨酸對下丘腦和肝臟蛋白組分的影響。結果顯示:下丘腦NPY的含量在1.27％精氨酸組表現為最高（P＜0.05）;隨著精氨酸水平的增加，血清NO含量表現為升高的趨勢，1.27％精氨酸組胃饑餓素含量顯著低于其他各組(P＜0.05)。質譜鑒定到的下丘腦蛋白共計3715個，0.64％精氨酸組與1.27％精氨酸組差異表達蛋白235個(P＜0.05);

5、質譜鑒定到的肝臟蛋白共計3797個，兩組間共有373個蛋白表達差異顯著（P＜0.05）。結果提示:飼糧中適宜水平的精氨酸可以通過提高下丘腦NPY和血清NO的含量，降低血清胃饑餓素的含量，進而提高蛋雞的采食量;精氨酸對采食量的調控可能與其提高了下丘腦激素相關蛋白的表達水平，同時降低了肝臟脂肪酸氧化相關蛋白的表達水平有關。
　　3精氨酸對蛋雞組織蛋白質代謝的調控研究
　　本研究探討了精氨酸對蛋雞肝臟和小腸蛋白質代謝的影響及其調控

6、作用的分子機制。結果顯示:1.27％精氨酸組血清總蛋白和白蛋白含量最高(P＜0.05)，血清尿酸含量最低（P＜0.05）;與基礎飼糧組相比，1.27％精氨酸組肝臟和空腸蛋白質相對合成率最高（P＜0.05）;RT-PCR和Western blot檢測TOR信號通路相關基因的表達水平發(fā)現，1.27％精氨酸組肝臟TOR、S6K1基因mRNA相對表達量及TOR蛋白磷酸化最高(P＜0.05)，蛋白質降解相關基因20S蛋白酶體和組織蛋白酶B基因mR

7、NA相對表達量最低（P＜0.05）;此外，與基礎飼糧組相比，1.27％精氨酸組空腸TOR蛋白相對表達量及磷酸化水平均顯著提高(P＜0.05)。結果提示:飼糧中添加適宜水平的精氨酸可以提高蛋雞肝臟和空腸蛋白質相對合成率和蛋白質相對生長率，精氨酸對肝臟蛋白質合成的促進作用是通過上調TOR蛋白的表達和磷酸化水平以及抑制組織蛋白酶B和20S蛋白酶體基因mRNA表達水平，而精氨酸對空腸蛋白質合成的促進作用主要是通過提高空腸TOR蛋白的表達和磷酸化

8、水平以及抑制20S蛋白酶體基因mRNA表達水平。
　　4雞胚小腸上皮細胞模型的建立
　　本試驗比較了不同日齡的雞胚通過不同的消化酶作用后對雞胚腸上皮細胞分離及體外培養(yǎng)的影響，旨在建立一種適宜的腸上皮細胞分離與培養(yǎng)方法，為后續(xù)試驗提供材料。選取14 d、16d和18d的SPF雞胚小腸腸段，分別用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、嗜熱菌蛋白酶及Ⅰ型膠原酶與嗜熱菌蛋白酶聯合消化。采用免疫組化及免疫熒光染色對細胞進行鑒定，MTT法檢測細胞增殖。

9、結果顯示:14d雞胚小腸腸段通過Ⅰ型膠原酶消化分離得到的腸上皮細胞貼壁及生長均較好;傳代培養(yǎng)后可以產生大量腸上皮細胞;免疫組化及免疫熒光染色顯示分離得到的細胞對細胞角蛋白18抗體呈陽性。結果提示:選用14d雞胚通過Ⅰ型膠原酶消化，可以分離得到較好的雞胚腸上皮細胞。
　　5精氨酸對雞小腸上皮細胞精氨酸轉運、代謝及相關基因表達的影響
　　以建立的雞胚小腸上皮細胞為模型，探討外源精氨酸對堿性氨基酸轉運載體1和4(CAT-1、CAT

10、-4)及誘導性一氧化氮合酶(iNOS)表達的影響。細胞在含10、100、200、400和600μM精氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后，結果顯示細胞活力在10-400μM精氨酸范圍內達到最大值;與10μM精氨酸組相比，外源添加100、200和400μM精氨酸顯著增加L-[3H]-精氨酸的吸收、細胞NO及L-[3H]-瓜氨酸的含量(P＜0.05); CAT-1基因mRNA和蛋白相對表達量隨著外源精氨酸濃度的增加而增加;精氨酸顯著上調iNOS基因mR

11、NA相對表達量（P＜0.05），200和400μM精氨酸組iNOS蛋白相對表達量顯著高于10和100μM精氨酸組(P＜0.05)。結果提示:精氨酸能夠提高CAT-1及iNOS基因的表達水平，增加外源精氨酸的利用率及NO的生成量;CAT-1對精氨酸的轉運發(fā)揮著重要作用，同時由精氨酸介導通過iNOS產生的NO能夠促進細胞生長。
　　6精氨酸對雞小腸上皮細胞蛋白質代謝及相關基因表達的影響
　　本試驗以雞小腸上皮細胞為模型，旨在探討

12、精氨酸對細胞蛋白質代謝及TOR通路相關基因表達的影響。細胞在含10、100、200和400μM精氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后，測定細胞周期、細胞蛋白質合成與降解、雷帕霉素靶蛋白(TOR)、核糖體蛋白S6激酶(S6K1)及真核生物起始翻譯因子4E結合蛋白(4E-BP1)基因mRNA相對表達量。結果顯示，S和G2/M期細胞數量隨著精氨酸濃度的增加而增加，而G0/G1期則降低;與10μML-精氨酸相比，100、200和400μM精氨酸組細胞蛋白質