Survivin在腎癌組織中的表達(dá)及Survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡及機制的研究.pdf

1、腫瘤是一類細(xì)胞增殖周期紊亂性疾病，細(xì)胞增殖和凋亡的失衡可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對細(xì)胞周期的調(diào)控在腫瘤的發(fā)生和治療中起重要作用。不可控制的細(xì)胞增殖是癌癥的特征。惡性腫瘤的增殖從生物學(xué)角度看主要表現(xiàn)在兩個方面：一方面是腫瘤細(xì)胞的“不滅性”，即凋亡障礙；另一方面是細(xì)胞分裂的失控，即細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)的障礙。Survivin是近來分離的哺乳動物凋亡抑制劑，具有與其他凋亡基因不一樣的特性，即在良好分化的正常組織中不表達(dá)，但是廣泛表達(dá)于各種腫瘤

2、組織。它在腫瘤中高表達(dá)反映了凋亡抑制在腫瘤進(jìn)展中的作用，而它在有絲分裂中的作用引起了人們對于細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的興趣。 目的通過免疫組化和RT-PCR方法檢測了Survivin在腎癌組織和腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，通過反義寡核苷酸技術(shù)，觀察了其對腎癌細(xì)胞凋亡的影響，探討其對腫瘤細(xì)胞影響的途徑。 方法：(1)應(yīng)用免疫組化方法檢測66例腎癌患者和20例正常腎組織中Survivin的表達(dá)情況，應(yīng)用RT-PCR和Westernbl

3、ot檢測6例腎癌組織，6例正常腎組織及兩種腎癌細(xì)胞系786-0和ACHN中SurvivinmRNA的表達(dá)情況。(2)通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的Survivin反義寡核苷酸技術(shù)，采用電鏡，免疫組化，westernblot，RT-PCR和流式細(xì)胞儀等手段，觀察Survivin反義寡核苷酸對腎癌細(xì)胞凋亡、增殖的影響。 結(jié)果： (1)66例腎癌組織均有不同程度的Survivin表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿和細(xì)胞膜，為淺黃色和棕黃色。20例正

4、常腎組織很少見到Survivin蛋白的表達(dá)。腎癌組織和正常腎組織吸光度分別為0.031±0.002和0.875±0.124，兩者比較，差異具有顯著性意義(p＜0.01)。不同病理類型透明細(xì)胞癌，嗜色細(xì)胞癌和嫌色細(xì)胞癌吸光度值分別為0.873±0.091，0.904±0.103和0.813±0.126，各類型間差異無顯著性意義。不同病理分級腎癌組織G1，G2，G3和G4吸光度值分別為0.693±0.092，0.762±0113，0.876

5、±0.106和0.903±0.092，各級間比較，差異具有顯著性意義(p＜0.05)。不同腎癌臨床分期Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ吸光度值分別為0.864±0.121，0.884±0.093和0.853±0.106，各期間比較，差異無顯著性意義。Westernblot和RT-PCR檢測結(jié)果顯示，正常腎組織表達(dá)陰性，腎癌組織和兩種腎癌細(xì)胞系786-0和ACHN均有不同程度的Survivin蛋白和mRNA表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)表明差異有顯著性意義。 (2)

6、SurvivinASODN轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化：轉(zhuǎn)染結(jié)束后可見細(xì)胞皺縮，細(xì)胞膜微絨毛消失，染色質(zhì)濃縮，致密的凋亡小體亦較多。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示survivn蛋白陽性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃至棕黃色染色；空白對照組和SODN組染色較強，而ASODN組明顯減弱。各組細(xì)胞均有不同程度的特異性Survivin基因條帶表達(dá)，空白對照組和正義對照組表達(dá)最強，而ASODN組表達(dá)相對較弱。RT-PCR結(jié)果與空白對照組和正義對照組相比，ASOD

7、N組表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果也顯示，與空白對照組和SODNSurvivin蛋白表達(dá)水平相比較，ASODN組表達(dá)亦明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀定量檢測凋亡細(xì)胞，DNA直方圖可見轉(zhuǎn)染后二倍體峰(G1期細(xì)胞)減少，G1峰左側(cè)出現(xiàn)明顯的凋亡峰(亞二倍體峰)，G2/M期呈明顯增加趨勢。各組細(xì)胞凋亡分別為6.05±0.48％，5.70±041％，10.54±0.72％，12.80±0.38

8、％，22.30±1.23％，三組實驗組細(xì)胞凋亡均較對照組有顯著增加。ASODN對細(xì)胞凋亡的影響呈濃度依賴關(guān)系。經(jīng)MTT法檢測，800ng/mlASODN作用24h，48h和72h后，腎癌細(xì)胞抑制率分別為38.5±2.6％，52.9±3.4％和62.2±3.8％，呈現(xiàn)時間依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)本研究應(yīng)用免疫組化的方法在66例腎癌組織和20例正常腎組織檢測發(fā)現(xiàn)，正常腎組織不表達(dá)Surv

9、ivin，而腎癌組織不同程度表達(dá)Survivin蛋白，表明Survivin和腎癌的發(fā)生有關(guān)。 (2)本研究表明，不同病理類型，不同臨床分期間，Survivin的表達(dá)差異無顯著性意義，Survivin的表達(dá)隨著分化程度的降低而增高，說明Survivin表達(dá)和腎癌的分化程度有關(guān)，和腎癌的發(fā)展有關(guān)，可以用來作為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。 (3)本實驗利用反義技術(shù)，合成并轉(zhuǎn)染靶向Survivin的反義寡核苷酸，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染成功后，腎

10、癌細(xì)胞系786-0中SurvivinmRNA和蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。提示可以通過Survivin途徑治療腎癌。 (4)本實驗表明Survivin的反義寡核苷酸對腎癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量-時間依賴效應(yīng)，進(jìn)一步證實了Survivin的反義寡核苷酸治療腎癌的有效性。 (5)Survivin的反義寡核苷酸通過封閉Survivin的表達(dá)，誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的生長停滯于G2/M期，使之無法完成有絲分裂，從而抑制腎癌細(xì)胞的增殖活性。