siRNA干擾胃癌BGC-823細(xì)胞中polβ表達(dá)的初步研究.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文siRNA干擾胃癌BGC823細(xì)胞中polβ表達(dá)的初步研究姓名：王蕾申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：趙國(guó)強(qiáng)董子明20070501鄭州人學(xué)2007屆碩士研究生畢業(yè)論文中文摘要(posttranscriptionalgenesilencing，PTGS)現(xiàn)象。該技術(shù)能夠有效使轉(zhuǎn)錄后基因沉默，甚至可以代替基因敲除，是目前研究基因調(diào)控的重要手段。本研究構(gòu)建polB基因靶向的siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)

2、胞株BGC一823中，檢測(cè)該細(xì)胞中polB基因表達(dá)的沉默效果，同時(shí)初步觀察polB基因表達(dá)抑制后對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)方法利用Takara、Ambion和PromegasiRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，掃描人polBcDNA編碼序列(M13140)，依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則，經(jīng)BLAST同源性分析，選擇確定19個(gè)堿基的siRNA靶序列。分別合成2對(duì)靶向pol8siRNA序列和一對(duì)無(wú)關(guān)siRNA的DNA單鏈，退火成雙鏈DNA，用Ba

3、mHl和XhoI雙酶切siRNA表達(dá)載體pRNAT—U61；將具有相同酶切位點(diǎn)的發(fā)卡樣siRNA片段克隆入siRNA表達(dá)載體pRNAT—u61中；利用PCR擴(kuò)增法篩選鑒定重組子pRNAT—U6卜sipolBl、pRNAT—U6卜sipolB2、pRNAT—U6卜Con；對(duì)插入序列進(jìn)行DNA序列分析。將siRNA表達(dá)載體pRNAT—U6卜sipolB1、pRNAT—U6卜sipolB2、pRNAT—u61Con轉(zhuǎn)入人胃癌細(xì)胞系BGC一82

4、3中，同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載體pRNAT—U61)和空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)；用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞polpmRNA表達(dá)水平；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖率，并將各組的細(xì)胞注射裸鼠皮下組織以觀察腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的增殖情況，最后用熒光定量PCR檢測(cè)各組腫瘤組織中polBmRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1初步篩選得到27個(gè)后選片段，對(duì)這些候選序列通過(guò)同源序列檢索和進(jìn)一步優(yōu)選，最終確定5’274—292位(GAACGTGAGCCA

5、AGCTATC)和661—679位(GATTCGGCAGGATGATACG)為siRNA靶序列，并選擇一無(wú)關(guān)對(duì)照的發(fā)卡樣DNA序列。2siRNA發(fā)卡DNA的退火后三個(gè)退火產(chǎn)物sipolB1、sipolB2和Con，電泳可見(jiàn)三條明亮條帶，位于約70bp處，與設(shè)計(jì)完全一致。3成功構(gòu)建重組子pRNAT—U6卜sipolB1、pRNAT—U6卜sipolB2和pRNAT—U61Con，測(cè)序分析其序列與設(shè)計(jì)完全一致。4轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀