瑞舒伐他汀鈣對(duì)家兔血管內(nèi)膜增生抑制的研究.pdf

1、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)和支架植入術(shù)是目前治療冠心病的重要手段，但術(shù)后的支架再狹窄嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期療效。雖然以往人們探討了許多方法希望能解決再狹窄問(wèn)題，包括高壓球囊擴(kuò)張、再次植入支架、球囊旋切術(shù)、激光成形術(shù)等，但仍有10％-30％的患者會(huì)在支架內(nèi)及支架邊緣出現(xiàn)再狹窄。尋找合適的藥物預(yù)防和治療支架再狹窄對(duì)于減少冠心病患者心血管事件的發(fā)生、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)壽命及減輕國(guó)家和個(gè)人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重大意義。內(nèi)膜增殖是支架再狹窄的主要病理改

2、變，局部炎癥反應(yīng)是主要原因，應(yīng)用抗炎治療有可能減輕內(nèi)膜增生。瑞舒伐他汀鈣(Rosuvastatin)是新型的他汀類藥物，現(xiàn)在已經(jīng)證明具有明顯的降低低密度脂蛋白膽固醇作用。一些實(shí)驗(yàn)和臨床研究顯示瑞舒伐他汀鈣具有改善內(nèi)皮功能、降低氧化型低密度脂蛋白、減輕炎癥、穩(wěn)定斑塊等獨(dú)立于降脂之外的減輕動(dòng)脈硬化進(jìn)展的作用，本研究先通過(guò)制作家兔球囊損傷動(dòng)物模型，觀察瑞舒伐他汀鈣在對(duì)損傷血管的反應(yīng)，探討瑞舒伐他汀鈣在損傷內(nèi)膜的血管中的作用，再通過(guò)培養(yǎng)血管平滑

3、肌細(xì)胞(VSMC)，從細(xì)胞水平觀察瑞舒伐他汀鈣對(duì)VSMC中TGF-β1基因表達(dá)的影響，探討其在防治支架再狹窄中的地位，為治療支架再狹窄提供理論依據(jù)。
　　 第一部分：
　　 目的：比較不同大小球囊導(dǎo)管制作血管內(nèi)膜損傷動(dòng)物模型的效果，尋找合適的球囊導(dǎo)管和制作方法制作血管內(nèi)膜損傷的動(dòng)物模型。
　　 方法：我們采用健康雄性新西蘭兔30只，適應(yīng)喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分成三組各10只：其中10只做為假手術(shù)組進(jìn)行對(duì)照，其余20只分為

4、2.5mm球囊組和3.5mm球囊組制做球囊損傷模型。分別采用不同大小2.5mm*15mm和3.5mm*15mm的球囊導(dǎo)管經(jīng)股動(dòng)脈制作腹主動(dòng)脈球囊損傷的動(dòng)物模型，三組均予阿斯匹林25mg1/日，氯比格雷25mg1/日灌胃，分組喂養(yǎng)4周后用氣體栓塞法處死兔，截取球囊損傷處血管組織2cm節(jié)段，制成厚5μm切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜厚度，分別計(jì)算橫截面管腔內(nèi)徑、新生內(nèi)膜層和中部平滑肌細(xì)胞層的平均厚度，計(jì)算3個(gè)視野的平均值

5、，最后計(jì)算內(nèi)膜/中膜比值。
　　 結(jié)果：
　　 1、手術(shù)后一般情況比較：所有家兔均順利完成手術(shù)，手術(shù)時(shí)間10～40min，假手術(shù)組手術(shù)時(shí)間為15.5±3.28min明顯短于2.5mm球囊組手術(shù)時(shí)間28.6±4.09min和3.5mm球囊組的34.9±6.06min，三組手術(shù)時(shí)間兩兩相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(P＜0.05)。三組中26只術(shù)后第2日開(kāi)始進(jìn)食水，3只術(shù)后第3日開(kāi)始進(jìn)食水，1周后均恢復(fù)正常飲食及運(yùn)動(dòng)。4周喂養(yǎng)時(shí)間內(nèi)只

6、有1只家兔第3周死于腹瀉，其余29只家兔均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，存活者無(wú)并發(fā)癥出現(xiàn)，造模成功率95％，兩組術(shù)后進(jìn)食、恢復(fù)運(yùn)動(dòng)活力情況均無(wú)明顯差異。
　　 2、光鏡下觀察內(nèi)膜增生情況：HE染色顯示，光鏡下可見(jiàn)球囊損傷的兩組管壁均不光滑，內(nèi)膜增厚，管腔狹窄，部分內(nèi)彈力板斷裂，內(nèi)彈力層附近的血管平滑肌細(xì)胞縱向排列，呈向內(nèi)膜方向生長(zhǎng)的趨勢(shì)，動(dòng)脈平均狹窄程度同假手術(shù)組相比分別為22.1±3.5％和32.5±5.8％，三組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3.

7、5mm球囊組狹窄重于2.5mm球囊組，2.5mm球囊組重于假手術(shù)組。內(nèi)膜厚度3.5mm球囊組為0.07±0.03mm大于2.5mm球囊組0.03±0.02mm和假手術(shù)組0.02±0.03mm，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。3.5mm球囊組中膜厚度為0.16±0.03mm大于假手術(shù)組的0.12±0.02mm，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而與2.5mm球囊組0.14±0.02mm相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。內(nèi)膜/中膜3.5mm球囊組

8、為0.44±0.11大于2.5mm球囊組0.21±0.05大于假手術(shù)組0.17±0.06，三組兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
　　 (P＜0.05)。
　　 結(jié)論：采用直徑為3.5mm的球囊導(dǎo)管制作血管內(nèi)膜損傷動(dòng)物模型優(yōu)于直徑為2.5mm的球囊導(dǎo)管，直徑為3.5mm的球囊導(dǎo)管是制作腹主動(dòng)脈球囊損傷較理想的球囊導(dǎo)管。
　　 第二部分：
　　 目的：觀察瑞舒伐他汀鈣對(duì)家兔血管內(nèi)膜損傷的影響。
　　 方法：我們

9、采用健康雄性新西蘭兔20只，采用3.5mm*15mm的球囊經(jīng)股動(dòng)脈制作腹主動(dòng)脈球囊損傷的動(dòng)物模型，造模成功后隨機(jī)分成對(duì)照組和他汀組各10只，兩組均予阿斯匹林25mg1/日，氯比格雷25mg1/日灌胃，他汀組加用瑞舒伐他汀鈣1mg/(kg·d)，分組喂養(yǎng)6周后從耳緣靜脈采集靜脈血5ml，采用酶法測(cè)定血生化指標(biāo)：總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL_C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL_C)，肝腎功能、血糖、同型半胱氨

10、酸等。同時(shí)采用經(jīng)頸動(dòng)脈行腹主動(dòng)脈造影后，采用同一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)影像進(jìn)行分析，應(yīng)用數(shù)字減影血管造影儀(德國(guó)西門子，COROSKO-PHS)作血管狹窄定量分析。隨后空氣栓塞法處死家兔，截取球囊損傷處血管組織2cm節(jié)段，常規(guī)石蠟包埋，制成厚5μm切片，行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜及中膜厚度，分別計(jì)算橫截面管腔內(nèi)徑、新生內(nèi)膜層和中部平滑肌細(xì)胞層的平均厚度，計(jì)算內(nèi)膜/中膜比值。
　　 結(jié)果：
　　 1、兩組家兔血生化結(jié)果：兩組家

11、兔相比肝功能、腎功能、同型半胱胺酸沒(méi)有顯著差異，在血脂方面瑞舒伐他汀組TC0.8±0.45mmol/L，TG0.9±0.22mmol/L及LDL_C0.4±0.05mmol/L明顯低于對(duì)照組中TC1.2±0.45mmol/L，TG1.3±0.32mmol/L及LDL_C0.6±0.11mmol/L(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、家兔腹主動(dòng)脈造影結(jié)果：術(shù)后第6周行腹主動(dòng)脈造影見(jiàn)血管遠(yuǎn)段髂動(dòng)脈分叉前5cm左右血管內(nèi)膜不光

12、滑，血管腔明顯狹窄30％-50％，他汀組血管狹窄段最小內(nèi)徑(1.74±0.25mm)明顯較對(duì)照組(1.32±0.33mm)大，狹窄程度他汀組31.41％±7.08％明顯較對(duì)照組55.25％±10.23％輕，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而參照血管內(nèi)徑、管腔狹窄長(zhǎng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＞0.05)。
　　 3、HE染色結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)兩組管壁均不光滑，內(nèi)膜增厚，管腔狹窄，內(nèi)彈力層附近的血管平滑肌細(xì)胞縱向排列，呈向內(nèi)膜方向生長(zhǎng)的趨勢(shì)，

13、經(jīng)過(guò)圖像分析系統(tǒng)處理：他汀組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜（0.04±0.02mm，0.29±0.10）較對(duì)照組(0.08±0.03mm，0.50±0.11)減少了55％和42％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而橫截面管腔橫徑(3.3±0.32mmvs3.1±0.26mm)，他汀組較對(duì)照組增加了7％，和中膜厚度(0.14±0.02vs0.16±0.01)兩組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：瑞舒伐他汀鈣具有明顯的降低LDL_C

14、、TC、TG作用。腹主動(dòng)脈造影和HE染色提示它還具有抑制球囊損傷血管內(nèi)膜增生的作用。
　　 第三部分：
　　 目的：觀察瑞舒伐他汀鈣對(duì)內(nèi)膜損傷家兔血管壁中TGF-β1表達(dá)的影響。
　　 方法：采用前述經(jīng)股動(dòng)脈損傷后制作腹主動(dòng)脈球囊損傷的動(dòng)物模型制成的石蠟切片，采用免疫組化檢測(cè)組織中TGF-β1蛋白表達(dá)情況；部分截取的腹主動(dòng)脈壁，采用Trizol抽提總RNA，測(cè)定RNA純度、濃度后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況。

15、UVP型凝膠密度掃描儀對(duì)TGF-β1、β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶進(jìn)行密度掃描，計(jì)算相對(duì)比值。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫組化發(fā)現(xiàn)兩組動(dòng)物內(nèi)膜及中膜內(nèi)有染色為棕褐色的TGF-β1蛋白表達(dá)，瑞舒伐他汀組平均吸光度為0.413±0.13，TGF-β1陽(yáng)性面積率為22.37±4.42％均明顯低于對(duì)照組的0.568±0.17和40.58±7.45％(P＜0.05)，兩組相比有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、RT-

16、PCR檢測(cè)：RT-PCR檢測(cè)顯示兩組動(dòng)物內(nèi)膜中均有有247bp的TGF-β1擴(kuò)增產(chǎn)物。瑞舒伐他汀處理組表達(dá)值為25.32±5.13較對(duì)照組42.47±5.41明顯減弱，兩組相比有差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：瑞舒伐他汀鈣具有抑制球囊損傷家兔血管壁中TGF-β1蛋白表達(dá)和基因表達(dá)的作用。
　　 第四部分：
　　 目的：觀察瑞舒伐他汀鈣對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中TGF-β1和SMAD3表達(dá)的影響。<

17、br>　　 方法：原代培養(yǎng)臍靜脈平滑肌細(xì)胞，傳代至3-6代時(shí)分別予10-7至10-3mmol/L濃度的瑞舒伐他汀鈣刺激12h、24h后收集細(xì)胞，WESTERN-BLOT檢測(cè)TGF-β1和SMAD蛋白表達(dá)情況，RT-PCR檢測(cè)TGF-β1基因表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫印跡結(jié)果顯示瑞舒伐他汀鈣在10-7-10-3mol/L的濃度刺激均抑制TGF-β1蛋白表達(dá)。在刺激12h后，瑞舒伐他汀鈣濃度為10-7-10-

18、5mol/L的各組之間隨濃度增加TGF-β1蛋白表達(dá)量逐漸減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，繼續(xù)增加瑞舒伐他汀鈣的濃度TGF-β1蛋白表達(dá)量不再減少，反而有增加趨勢(shì)，104mol/L和10-3mol/L兩組較10-5mol/L組表達(dá)量有所增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；刺激24h后瑞舒伐他汀鈣的濃度為10-7-10-3mol/L的各組TGF-β1蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯降低，差別顯著(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在10-7-10-3mol/

19、L的各組之間無(wú)顯著差異，(P＞0.05)。
　　 2、瑞舒伐他汀鈣對(duì)VSMC中TGF-β1基因表達(dá)的影響：在刺激3h后，瑞舒伐他汀鈣濃度為10-5-10-3mol/L的三個(gè)組TGF-β1mRNA的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，10-3mol/L和10-4mol/L組TGF-β1mRNA的表達(dá)量低于10-5mol/L組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，10-7mol/L和106mol/L組同對(duì)照組相比無(wú)

20、明顯差異(P＞0.05)；刺激6h后瑞舒伐他汀鈣濃度為10-7-10-3mol/L的五個(gè)組TGF-β1mRNA的表達(dá)量均低于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.05)，TGF-β1mRNA表達(dá)量隨瑞舒伐他汀鈣濃度的增加而減少，瑞舒伐他汀鈣濃度在10-7mol/L至10-6mol/L之間TGF-β1mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P＞0.05)，但這兩組均高于10-5mol/L組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，10-3mol/L組TGF-β1m

21、RNA的表達(dá)量低于10-5mol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，10-4mol/L組和10-5mol/L組兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(P＞0.05)。
　　 3、SMAD3免疫印跡結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀鈣刺激12小時(shí)之后，10-5-10-3mol/L的三組SMAD3蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的84.65±14.5％、70.65±8.71％、78.25±5.21％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而10-7和10-6mol/L兩組分

22、別為91.87±4.25％和92.75±8.24％，同對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，(P＞0.05)。同10-5mol/L組相比，只有10-4mol/L組表達(dá)量較低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。刺激24小時(shí)后，10-7-10-3mol/L的五組SMAD3蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的85.55±8.47％、75.69±7.24％、68.35±7.65％、57.57±9.32％和80.54±6.35％，各組均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。