狂犬病病毒誘導人和鼠神經母細胞瘤細胞自噬的研究.pdf

1、狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus,RABV）感染中樞神經系統(tǒng)而引起的一種烈性人獸共患傳染病。感染狂犬病病毒并出現(xiàn)臨床癥狀的人或動物幾乎百分之百死亡。預防和治療狂犬病成為近幾十年的重要課題之一，目前狂犬病以預防為主，而在治療方面成效寥寥。病毒是一種專性細胞寄生生物，其依賴生物體復制和傳播，因此，探討狂犬病病毒與細胞的生物互作尤為重要。
　　自噬，作為一種細胞自我保護性機制，進化上高度保守，廣泛存在于真核

2、生物，其主要功能是將細胞內生物大分子及損壞的細胞器在溶酶體內消化分解后供生物體重新利用，與凋亡、壞死一起稱為三大細胞死亡機制。自噬按其功能分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。
　　自噬和病毒關系的研究近些年報道較多，有些病毒具備了逃逸宿主細胞自噬的功能，有些病毒在長期的進化中學會了如何利用細胞自噬來促進自身轉錄與復制。彈狀病毒科的其他成員：水皰性口炎病毒(VSV),出血性敗血癥病毒(VHSV)和鯉春病毒血癥病毒(SVCV)能夠

3、誘導細胞自噬，但對于狂犬病病毒與細胞自噬關系的研究目前尚未報道，本研究從以下幾個方面對狂犬病毒與細胞自噬的關系進行探討。
　　一、狂犬病病毒的感染誘導SK和NA細胞發(fā)生自噬。為了明確狂犬病病毒是否能夠誘導細胞自噬，我們選擇生物學特性截然不同的兩株狂犬病病毒：強毒株GD-SH-01和弱毒株HEP-Flury病毒，通過對兩株病毒感染SK和NA細胞后的western-blot檢測，電鏡觀察以及轉染GFP-LC3B質粒后觀察GFP熒光點分

4、布的方法，我們最終確定狂犬病病毒強毒株GD-SH-01株病毒可以誘導明顯的細胞自噬，而弱毒株的自噬水平與未感染狂犬病病毒的空白細胞組相似。以上實驗結果證明細胞自噬的誘導是病毒株特異的。自噬誘導差異是否與強弱毒株特性相關還有待探討。
　　二、狂犬病病毒誘導的細胞自噬與凋亡的關系。細胞自噬作為一把雙刃劍，既是一種細胞保護性機制又可以誘導細胞走向死亡。細胞自噬和細胞凋亡同為細胞程序性死亡，其相關研究已有很多報道，主要概括為合作關系、對抗

5、關系及推動關系。我們的實驗結果證明狂犬病病毒強毒株GD-SH-01可以同時誘導細胞自噬和凋亡，接著我們探討了狂犬病病毒誘導的細胞自噬和凋亡的關系。我們通過增強其中一種現(xiàn)象來看另一種發(fā)生的變化的方法來進行研究，結果顯示在加入自噬增強劑的細胞組狂犬病病毒誘導的細胞凋亡現(xiàn)象明顯弱于未加藥物組，這個現(xiàn)象說明GD-SH-01誘導的細胞自噬是作為一種細胞保護性機制來消除病毒誘導的細胞凋亡這種不利細胞存活的生物學過程。
　　三、GD-SH-01

6、的M基因對自噬的影響。狂犬病病毒的基因組由5個結構蛋白構成：N，P，M，G，L，那么究竟是哪個基因在狂犬病病毒誘導細胞自噬方面起到最關鍵的作用呢，我們實驗室通過將GD-SH-01的單個結構蛋白基因與相對應HEP-Flury基因進行替換和病毒拯救，得到5株重組狂犬病病毒：rHEP-shN、rHEP-shP、rHEP-shM、rHEP-shG和rHEP-shL，通過對其感染細胞后細胞自噬水平的研究得出rHEP-shM與GD-SH-01一樣可

7、以誘導明顯的LC3-I/LC3-II轉換，而rHEP-shN、rHEP-shP、和rHEP-shG只能誘導較弱的細胞自噬。從而初步得出GD-SH-01的M基因在誘導細胞自噬方面起到最主要的作用。接下來，我們構建了4個質粒，它們分別可以表達結構蛋白與mRFP蛋白融合的融合蛋白。質粒轉染細胞后我們發(fā)現(xiàn)單個蛋白在細胞中的表達并不能誘導細胞自噬，因此GD-SH-01誘導的細胞自噬是與病毒粒子的特性有關而不是單個狂犬病病毒結構蛋白可以誘導的。