大麥種質(zhì)資源遺傳多樣性及貯藏蛋白基因克隆研究.pdf

1、本文通過對(duì)我國(guó)大麥地方品種、近緣野生材料的農(nóng)藝性狀考察和蛋白質(zhì)含量測(cè)定，從中篩選出綜合性狀好或者具有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良性狀優(yōu)異種質(zhì)46份。采用APAGE、RAPD、RAMP和ISSR標(biāo)記研究了它們之間的遺傳關(guān)系。對(duì)糙稃大麥低分子量谷蛋白基因和近緣野生大麥B-hordein基因進(jìn)行了分離、克隆和測(cè)序。主要結(jié)果如下： 1、對(duì)212份大麥種質(zhì)資源(包括105份近緣野生材料和107份地方品種)進(jìn)行了農(nóng)藝性狀考察和籽粒蛋白質(zhì)含量測(cè)定，結(jié)果表明

2、每個(gè)性狀的變異都較大。生育期138-～199d，株高61.2～140.5cm，有效穗數(shù)3～16個(gè)，穗長(zhǎng)3.9～17.8cm，小穗數(shù)16～30個(gè)，穗粒數(shù)20～97粒，千粒重21.8～59.1g，穗粒重0.5～2.9g，蛋白質(zhì)含量9.80～22.14％。從中篩選出了46份綜合性狀好或者具有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良性狀的優(yōu)異種質(zhì)，為進(jìn)一步在育種和生產(chǎn)中加以利用提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。 2、對(duì)212份供試材料各考察性狀間的相關(guān)分析結(jié)果表明：有效

3、穗數(shù)與穗長(zhǎng)，小穗數(shù)與穗粒重呈顯著正偏相關(guān)，生育期與千粒重呈極顯著負(fù)偏相關(guān)，穗長(zhǎng)與穗粒數(shù)呈顯著負(fù)偏相關(guān)，其余性狀間偏相關(guān)均不顯著。表明9個(gè)性狀雖然具有較復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系，但是產(chǎn)量性狀(有效穗數(shù)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗粒重、千粒重)以及品質(zhì)性狀(蛋白質(zhì)含量)相互之間不存在顯著或極顯著的負(fù)效應(yīng)，在選擇時(shí)能夠較好地協(xié)調(diào)它們之間的關(guān)系。 3、利用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acid-polyacrylamidegelelectrophoresis，

4、APAGE)法檢測(cè)結(jié)果表明，46份供試材料具有豐富的醇溶蛋白等位變異，每份材料均具有唯一獨(dú)特的醇溶蛋白帶型，共分離出36條相對(duì)遷移率不同的譜帶，每份材料可電泳出15～26條，平均19條，有3條帶為所有材料共有，即醇溶蛋白帶紋的多態(tài)性為91.67％。材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.468～0.976，平均值為0.737。聚類分析發(fā)現(xiàn)，同一類群或者相同地理來源的材料能夠部分地聚成一類或亞類，表明醇溶蛋白圖譜類型與材料的類群和生態(tài)地

5、理環(huán)境有一定相關(guān)性。 4、利用RAPD標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，46份供試材料間遺傳差異明顯。32個(gè)引物共擴(kuò)增出116條DNA片段，其中84條具有多態(tài)性，每個(gè)引物可擴(kuò)增出1～8條DNA片段，平均為3.72條，多態(tài)性比率(PPB)為72.41％，平均多態(tài)信息量(PIC)為0.131，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.294，材料間遺傳相似系數(shù)GS變化范圍為0.768～0.979，平均值為0.880。聚類分析表明，RAPD標(biāo)記能將所有供

6、試材料完全區(qū)分開，聚類結(jié)果與材料的類群和地理來源有一定相關(guān)性。 5、利用RAMP標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，46份供試材料具有豐富的遺傳變異。22個(gè)RAMP引物共擴(kuò)增出114條DNA片段，其中96條具有多態(tài)性，每個(gè)引物可擴(kuò)增出1～10條DNA片斷，平均為5.27條，多態(tài)性比率(PPB)為84.21％，平均多態(tài)信息量(PIC)為0.281，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.598，材料間遺傳相似系數(shù)GS變化范圍為0.548～0.971，

7、平均值為0.828。聚類分析表明，RAMP標(biāo)記能將所有供試材料完全區(qū)分開，聚類結(jié)果與材料的類群和地理來源有一定相關(guān)性。 6、利用ISSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明，46份供試材料間遺傳差異明顯。19個(gè)ISSR引物共檢測(cè)到111條DNA片段，其中109條具有多態(tài)性，每個(gè)引物可獲得1～10條DNA片段，平均為5.95條，多態(tài)性比率(PPB)為98.20％，平均多態(tài)信息量(PIC)為0.431，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為2.019，材料

8、間遺傳相似系數(shù)GS變幅為0.218～0.927，平均值為0.681。聚類分析表明，ISSR標(biāo)記能將所有供試材料完全區(qū)分開，聚類結(jié)果與材料的類群和地理來源有一定相關(guān)性。 7、RAPD、RAMP和ISSR三種標(biāo)記雖然都能揭示出供試材料間的遺傳差異，但各自所揭示的多態(tài)性水平不同。其中，ISSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比率(PPB)、平均多態(tài)信息量(PIC)以及每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)均略高于RAMP標(biāo)記，RAMP標(biāo)記又略高于RAP

9、D標(biāo)記。ISSR標(biāo)記揭示的遺傳相似系數(shù)值的范圍最大，平均值最小，RAPD標(biāo)記揭示的遺傳相似系數(shù)值的范圍最小，平均值最大，RAMP標(biāo)記揭示的遺傳相似性系數(shù)范圍及其平均值居中，表明ISSR標(biāo)記揭示材料間的遺傳變異最高，其次為RAMP標(biāo)記，RAPD標(biāo)記揭示的材料間遺傳變異相對(duì)最低。綜合而言，三種標(biāo)記在檢測(cè)供試材料間的遺傳差異和遺傳多樣性方面，ISSR標(biāo)記是最佳選擇，其次為RAMP標(biāo)記，RAPD標(biāo)記相對(duì)要差一些。 8、為了比較RAPD、

10、RAMP以及ISSR三種分子標(biāo)記分析結(jié)果的相關(guān)程度和一致性，利用Mantel檢測(cè)對(duì)它們分別揭示的材料間的遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行了相關(guān)分析。結(jié)果表明：RAPD與RAMP標(biāo)記以及RAMP與ISSR標(biāo)記之間呈極顯著正相關(guān)(r值分別為0.3988和0.3024)，而RAPD與ISSR標(biāo)記之間相關(guān)性不顯著(r值為0.0436)。 9、通過基因組PCR方法，從糙稃大麥(H.brevisubulatumssp.turkestanicum)材料Y

11、0695中分離出3個(gè)LMW-GS基因，分別命名為Ht1、Ht2和Ht3。Ht1、Ht2和Ht3編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為924、924和903bp，相應(yīng)可編碼306、306和299個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白，且均具有信號(hào)肽、富含脯氨酸和谷氨酸的中部重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)、N-末端和C-末端非重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)的典型結(jié)構(gòu)。通過與來源于小麥和大麥的已知蛋白質(zhì)基因的氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，與B型大麥醇溶蛋白基因相比，Ht1、Ht2和Ht3同小麥低分子量谷蛋白基因具有更高相似性

12、與一致性。進(jìn)一步分析揭示，這3個(gè)基因與小麥低分子量谷蛋白基因間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系更近，聚在同一發(fā)育分枝。據(jù)此認(rèn)為，來自糙稃大麥的3個(gè)蛋白質(zhì)基因?qū)儆贚MW-m型亞基基因。 10、通過基因組PCR方法，從蛋白質(zhì)含量高達(dá)22.14％的西藏近緣野生大麥(H.vulgaressp.agriocrithon)材料ZYM0834中分離出了3個(gè)Bhordein基因，分別命名為Ha1、Ha2和Ha3。Ha1、Ha2和Ha3編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為900、945

13、和975bp，相應(yīng)可編碼297個(gè)、312個(gè)和322個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白，且均具有信號(hào)肽、富含脯氨酸和谷氨酸的中部重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)和C-末端非重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)的典型結(jié)構(gòu)。3個(gè)基因的編碼區(qū)中均沒有內(nèi)含子，氨基酸序列一致性高達(dá)94.02％，等電點(diǎn)pI分別為7.04、8.40和8.30，分子量分別為33.75kD、35.30kD和36.81kD，分別含有7、7和8個(gè)半胱氨酸殘基。與已知Bhordein基因推導(dǎo)的氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)，Ha1與pBHR18