hAMSCs對翼狀胬肉成纖維細胞抑制作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬通過體外分離、培養(yǎng)人羊膜間充質干細胞,研究其對翼狀胬肉成纖維細胞的抑制作用,并初步研究其能否在體外誘導分化為眼表細胞,為用于翼狀胬肉的眼表修復提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、使用兩步酶消化法分離hAMSCs,胰酶-EDTA消化去除羊膜上皮細胞,膠原酶Ⅳ消化分離hAMSCs。流式細胞分析法鑒定hAMSCs表面抗原分子,分化培養(yǎng)基體外誘導分化為脂肪細胞和骨細胞鑒定其分化能力。
　　2、使用Tr

2、answell共培養(yǎng)體系將hAMSCs與hPFs共培養(yǎng),免疫熒光化學法及Wester-Blot法檢測hPFs中α-SMA的表達,同時行移行分析評估hAMSCs對hPFs移行的影響。
　　3、將hAMSCs與hBCFs在Transwell體系中共培養(yǎng),通過檢測hAMSCs細胞角蛋白19的表達水平評價其向眼表細胞分化的程度,通過檢測hAMSCs的α-SMA表達水平評價其分化機制與間質上皮化過程的相關性。
　　結果：
　　1

3、、本實驗方法分離hAMSCs體外貼壁生長,呈現(xiàn)成纖維細胞樣,在體外能傳代生長,經(jīng)傳代培養(yǎng)的hAMSCs表達間質干細胞表面抗原分子CD44、CD73與CD90,不表達白細胞抗原CD45。經(jīng)間充質干細胞成骨分化培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)3～4周后,其分化所得的細胞行茜素紅S染色為紅色;經(jīng)間充質干細胞成脂分化培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)1～2周后,行油紅O染色為亮紅色。
　　2、行共培養(yǎng)后,免疫熒光細胞化學分析顯示hPFs的α-SMA表達水平明顯降低,相同的結果

4、通過Western-Blot分析得到證實,移行分析顯示在移行分析的24小時、48小時和72小時,共培養(yǎng)組中hPFs的移行速度明顯慢于非共培養(yǎng)組。
　　3、與hBCFs共培養(yǎng)一周后,免疫熒光細胞化學法顯示hAMSCs的α-SMA表達水平顯著降低,并且部分hAMSCs的CK19表達陽性。
　　結論：
　　1、采用兩步酶消化法能獲得hAMSCs,所分離的細胞能在體外貼壁生長、穩(wěn)定傳代。
　　2、hAMSCs表面分子CD