細胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達通過增加脂肪酸氧化改善小鼠高脂血癥.pdf

1、研究背景和目的：
　　高脂血癥又稱為血脂代謝紊亂或異常，是由脂質代謝紊亂引起的一種代謝性疾病，主要是指血漿或血清中的甘油三酯（TG）水平、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）升高和（或）高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）水平降低。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥是動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，并與心血管疾病如冠心病、心肌梗死及腎臟疾病、胰島素抵抗、脂肪肝的發(fā)病率與死亡率之間存在著明顯的正相關。流行病學研究表明

2、，隨著我們國家經濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，高脂血癥的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。如果不能進行有效的干預，高脂血癥及其相關疾病將會成為影響人類身體健康及生活質量的一個重要危險因素。
　　花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）是生物體內一種含量豐富、分布極為廣泛的多不飽和脂肪酸，是體內多種重要生物活性物質的前體。當刺激作用于細胞時，細胞膜磷脂在磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2）的脂解作用下釋放出花生

3、四烯酸進入胞漿，花生四烯酸通過環(huán)氧化酶（COX）、脂氧化酶（LOX）及細胞色素P450表氧化酶（Cytochrome P450，CYP450）等三種酶途徑進行代謝。細胞色素P450表氧化酶主要包括2C和2J兩類，在人體內許多組織中均有表達?；ㄉ南┧嵩贑YP450的作用下生成四種環(huán)氧-二十碳三烯酸（5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET和14,15-EET）。體內EETs在可溶性表氧化物水解酶（sEH）的作用下水解生成二羥基

4、-20碳三烯酸（DHET）。CYP450-EETs在維持機體心血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。EETs具有擴張血管，降低血壓的作用，其機制可能與激活 Ca2+敏感的 K+通道，引起血管平滑肌細胞超極化有關；EETs可以通過激活絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）信號通路，促進內皮細胞的增殖及新生血管形成；EET可以明顯減輕TNF-α誘導的內皮細胞凋亡，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路，

5、增加抗凋亡蛋白BCL-2的表達有關；EET可以顯著降低血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達，且 EET可以通過抑制核轉錄因子（NF-κB），抑制單核細胞對血管壁的黏附來發(fā)揮抗炎作用。此外，EETs不僅能明顯促進腫瘤的遷移和侵襲生長，還在改善胰島素抵抗、糖尿病腎病及肥胖等代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用。
　　在本實驗研究中，我們假設CYP2J2基因過表達，使體內EETs的水平增加，從而增加了肝臟組織及血管的脂肪酸氧化，改善了高脂飲

6、食誘導的小鼠高脂血癥。因此，我們探討了CYP2J2基因過表達對高脂飲食誘導的小鼠高脂血癥的影響及其可能的分子機制，并在體外研究CYP2J2過表達或外源性加入EETs對肝細胞（HepG2、LO2）及內皮細胞（HUVECs）脂質代謝異常模型的影響及其可能涉及的分子機制，從而明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠改善高脂飲食誘導的脂質代謝異常。
　　一、體內實驗 CYP2J2基因過表達改善高脂飲食誘導的小鼠高脂血癥的作用及其機制

7、　　實驗目的：探討CYP2J2基因過表達改善高脂飲食誘導的小鼠高脂血癥的作用及其可能涉及的分子機制。
　　實驗方法：
　　1.高脂血癥小鼠模型的建立：8周齡健康雄性內皮特異性CYP2J2過表達轉基因（Tie2-CYP2J2-Tr）小鼠和野生型 C57BL/6J小鼠各20只隨機分為四組：普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）：n=10，野生型C57BL/6J小鼠，給予普通飲食喂養(yǎng)；普通飲食+Ti

8、e2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）：n=10，內皮特異性 CYP2J2過表達轉基因（Tie2-CYP2J2-Tr）小鼠，給予普通飲食喂養(yǎng)；高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）：n=10，野生型C57BL/6J小鼠，給予高脂飲食喂養(yǎng)；高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）：n=10，內皮特異性 CYP2J2過表達轉基因（Tie2-CYP

9、2J2-Tr）小鼠，給予高脂飲食喂養(yǎng)。按上述實驗分組分別給予普通飲食和高脂飲食喂養(yǎng)16周后，檢測相應指標。
　　2.實驗中稱取并記錄各組小鼠體重，留取小鼠血標本離心后于-80℃保存；實驗結束前留取各組小鼠24小時尿液標本，加入二甲胺離心后放置于-80℃冰箱備用。實驗結束后用戊巴比妥麻醉（50 mg/kg）并處死實驗動物，留取血標本，同時留取各組小鼠肝臟、血管、心臟、主動脈、皮下及內臟脂肪、腎臟等標本在4％甲醛溶液中固定，于脫水機中

10、脫水浸臘后，使用石蠟包埋機包埋組織后存放于室溫備用（注：皮下脂肪和內臟脂肪于4%甲醛固定前稱重）。
　　3.檢測各組小鼠血清及肝臟中甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、β-羥基丁酸的水平及血清中谷丙轉氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）的水平；
　　4.采用H&E及油紅染色方法評估各組小鼠肝臟的形態(tài)學改變；
　　5.采用GC-FID/MS檢測血及肝臟中脂肪酸的水平；
　　6.采用實時定量PCR檢測小鼠肝臟及

11、血管組織中PPARα及CPT-1的表達；
　　7.Western blot方法檢測各組小鼠肝臟及血管脂肪酸氧化相關蛋白p-AMPKα，p-ACC，CPT-1和PPARα的表達。
　　實驗結果：
　　1.Western blot結果顯示，普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）肝臟及血管組織中均無CYP2J2蛋白表達，普通飲食+Tie2

12、-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）及高脂飲食+ Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）肝臟及血管組織中CYP2J2表達豐富（P<0.05），表明CYP2J2在Tie2-CYP2J2-Tr小鼠體內成功過表達。ELISA檢測尿液14,15-DHET結果顯示，普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）及高脂飲食+Tie2

13、-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）小鼠尿液中14,15-DHET的含量，均明顯高于普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）尿液中14,15-DHET的含量（P<0.05），提示CYP2J2基因可成功代謝花生四烯酸為EETs并發(fā)揮2.在普通飲食喂養(yǎng)下，野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠體

14、重、內臟及皮下脂肪含量并無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）；高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組的體重、皮下及內臟脂肪含量明顯高于普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）小鼠體重、皮下及內臟脂肪含量較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組明顯降低（P<0.05）。
　　3.高脂飲食可以顯著增加野生型C57BL/6J小鼠血及肝臟組織中甘油

15、三酯及膽固醇的含量（P<0.05）；高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）血及肝臟中甘油三酯的含量、肝臟中膽固醇的含量均明顯低于高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）（P<0.05）。雖然高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）血中膽固醇的含量有下降趨勢，但無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。這一結果表明CYP2J2基因過表達可以明顯抑制高脂飲

16、食誘導的血及肝臟中甘油三酯的增高。高脂飲食顯著降低野生型C57BL/6J小鼠血及肝臟組織中β-羥基丁酸的含量（P<0.05），而高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）血漿及肝臟中β-羥基丁酸的含量明顯高于高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）（P<0.05）。然而，普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（

17、Normal Chow+Tie2-CYP2J2）血及肝臟中甘油三酯、膽固醇及β-羥基丁酸的含量無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。上述結果表明 CYP2J2基因過表達顯著改善高脂血癥小鼠的脂質代謝異常。
　　4.高脂飲食可以顯著增加野生型 C57BL/6J小鼠血漿中 ALT及 AST的含量（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組ALT及AST的含量明顯低于高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠（P<0.05）；不

18、僅如此，肝臟H&E結果顯示給予野生型C57BL/6小鼠高脂飲食喂養(yǎng)16周后，小鼠肝臟組織中脂質積聚情況較普通飲食喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠明顯增多（P<0.05）；給予 Tie2-CYP2J2-Tr小鼠高脂喂養(yǎng)，其肝臟的脂質積聚情況較高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠明顯減輕，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；然而，普通飲食喂養(yǎng)條件下，C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的肝臟組織HE染色并無明顯差異（P>0.05）。上述結果在

19、各組小鼠肝臟組織的油紅染色中更進一步得到證實。這些結果表明CYP2J2過表達可以明顯降低肝臟組織中高脂飲食誘導的脂質積聚，從而改善了高脂血癥小鼠的肝臟功能。
　　5. GC-FID/MS結果反應了CYP2J2基因過表達后對小鼠血和肝臟組織脂肪酸含量的影響：高脂飲食可以顯著增加野生型 C57BL/6J小鼠血漿及肝臟組織中脂肪酸的含量（P<0.05），CYP2J2過表達可以顯著抑制高脂飲食誘導的肝臟脂肪酸的升高（P<0.05），但其對

20、血漿中脂肪酸的含量并無明顯影響，即高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組與高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組血中脂肪酸的含量并無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。同樣，在普通飲食喂養(yǎng)下，野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的血漿及肝臟中脂肪酸的含量并無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　6.實時定量 PCR結果顯示普通飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和普通飲食+

21、Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）肝臟及血管組織CPT-1及PPARα的表達水平無明顯差異（P>0.05）；高脂飲食可以顯著降低野生型C57BL/6J小鼠肝臟及血管組織中CPT-1及PPARα的表達（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）肝臟及血管組織CPT-1及PPARα的水平較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT

22、）明顯升高（P<0.05）。
　　7.Western blot結果顯示：普通飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）和普通飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（Normal Chow+Tie2-CYP2J2）小鼠肝臟及血管組織中p-AMPKα，p-ACC，CPT-1及PPARα的表達水平無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05）；高脂飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）小鼠肝臟及血管組織 p-A

23、MPKα，p-ACC，CPT-1及 PPARα的表達較普通飲食+野生型 C57BL/6J小鼠組（Normal Chow+WT）明顯降低（P<0.05），高脂飲食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠組（HFD+Tie2-CYP2J2）肝臟組織及血管中上述指標較高脂飲食+野生型C57BL/6J小鼠組（HFD+WT）明顯增高（P<0.05），表明 CYP2J2基因過表達顯著逆轉高脂飲食誘導的小鼠肝臟組織和血管脂肪酸氧化相關蛋白 p-AMPKα，

24、p-ACC，CPT-1及 PPARα的降低。
　　二、體外實驗 CYP2J2過表達及外源性EETs改善游離脂肪酸（FFA）誘導的HepG2、LO2及HUVECs脂質代謝異常的作用及其機制
　　實驗目的：探討 CYP2J2過表達及外源性 EETs改善游離脂肪酸（FFA）誘導的HepG2、LO2及HUVECs脂質代謝異常的作用及其可能的分子機制。
　　實驗方法：
　　1. HepG2、LO2細胞及HUVECs培養(yǎng)于含

25、10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待肝細胞（HepG2、LO2）及內皮細胞（HUVECs）生長到80%-90%匯合時消化并傳代，當細胞生長至70%-80%匯合并經同步化處理后，進行后續(xù)實驗。
　　2.重組腺相關病毒介導的CYP2J2及GFP基因（rAAV-CYP2J2及rAAV-GFP）轉染HepG2、LO2細胞及HUVECs，于熒光顯微鏡下觀察確定轉染成功后加入AMPKα抑制劑

26、（Compound C）、PPARα抑制劑（GW6471）及游離脂肪酸（FFA）處理24小時；
　　3.經同步化處理的HepG2、LO2細胞及HUVECs，給予AMPKα抑制劑（Compound C）、PPARα抑制劑（GW6471）、14,15-EET抑制劑（14,15-EEZE）及14,15-EET，F(xiàn)FA共同孵育24小時；
　　4.檢測干預的HepG2、LO2細胞及HUVECs內甘油三酯的水平；
　　5.West

27、ern blot方法檢測干預的細胞p-AMPKα，p-ACC，CPT-1及PPARα的蛋白表達。
　　實驗結果：
　　1. FFA誘導的HepG2、LO2細胞及HUVECs中甘油三酯的水平明顯高于無處理的細胞（P<0.05）。FFA組與FFA+rAAV-GFP組相比甘油三酯水平無明顯統(tǒng)計學差異（P>0.05），F(xiàn)FA+ rAAV-CYP2J2組各細胞甘油三酯水平較FFA組明顯降低，Compound C及GW6471均能逆轉r

28、AAV-CYP2J2的降甘油三酯作用（P<0.05）。同樣，F(xiàn)FA+14,15-EET組各細胞甘油三酯水平較FFA組顯著降低，14,15-EEZE及GW6471均能逆轉14,15-EET的降甘油三酯作用（P<0.05）。
　　2.Western blot檢測了HepG2、LO2細胞及HUVECs中脂肪酸氧化相關蛋白p-AMPKα，p-ACC及 CPT-1的表達。結果顯示與未干預細胞相比，F(xiàn)FA能顯著降低HepG2、LO2細胞及HU

29、VECs中p-AMPKα，p-ACC及CPT-1的蛋白表達（P<0.05），轉染rAAV-CYP2J2干預FFA誘導的細胞，較單純FFA干預可以明顯增加p-AMPKα，p-ACC，CPT-1的蛋白表達，而這一效應可以在一定程度上被Compound C阻斷（P<0.05），表明CYP2J2的降甘油三酯作用在一定程度上依賴于AMPKα/ACC/CPT-1信號通路。與上述結果相似，與單純FFA干預相比，14,15-EET可以明顯增加FFA干預

30、的細胞p-AMPKα，p-ACC及CPT-1的蛋白表達，14,15-EEZE在一定程度上阻斷了上述效應（P<0.05）。上述結果提示CYP2J2過表達或外源性給予14,15-EET可能通過增加脂肪酸β氧化相關蛋白的表達從而降低細胞甘油三酯的積聚。
　　3.Western blot結果顯示CYP2J2過表達能明顯逆轉FFA誘導的PPARα表達降低，而該效應在一定程度上被Compound C阻斷（P<0.05），表明PPARα在一定程

31、度上受AMPKα的調控。與未處理細胞相比，F(xiàn)FA誘導可降低細胞PPARα及CPT-1的表達，CYP2J2過表達或給予外源性14,15-EET可以明顯逆轉FFA誘導的PPARα及CPT-1表達的降低，該效應在一定程度上被 GW6471阻斷（P<0.05），該結果提示除AMPKα/ACC/CPT-1信號途徑外，CYP2J2過表達或給予14,15-EET尚可通過PPARα/CPT-1增加脂肪酸β氧化，從而達到降低細胞內TG含量的作用。

32、　　統(tǒng)計學分析：
　　應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據以均數(shù)±標準誤表示，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1. CYP2J2過表達可以明顯減輕高脂血癥小鼠體重、皮下及內臟脂肪含量，顯著改善高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠高脂血癥，減輕高脂血癥引起的肝臟脂肪酸及脂質積聚，提示CYP2J2過表達具有改善高脂血癥小鼠脂代謝異常的作用。
　　2.CYP2J2過表

33、達可以顯著增加肝臟組織及血管脂肪酸β氧化相關蛋白p-AMPKα，p-ACC，CPT-1及PPARα的表達。
　　3.CYP2J2過表達或外源性 EETs均可通過激活 AMPKα/ACC/CPT-1及PPARα/CPT-1信號通路，從而增加脂肪酸β氧化，最終改善細胞甘油三酯積聚；其中，PPARα在一定程度上受AMPKα的調控。
　　4.CYP表氧化酶-EETs系統(tǒng)通過增加脂肪酸β氧化，從而降低血漿及肝臟中甘油三酯含量，減輕肝臟