冠脈結合多次靜脈移植間充質干細胞治療慢性缺血性心臟病的實驗研究.pdf

1、缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是威脅人類健康的主要殺手之一，具有極高的致死率和致殘率。盡管多數(shù)患者能從經(jīng)皮冠狀動脈腔內血管成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)、冠狀動脈搭橋手術(coronary artery bypass graft，CABG)及藥物治療中獲益，但仍然有相當數(shù)量的慢性缺血性心臟病(chronic ische

2、mic heart disease，CHD)患者，他們因為冠脈病變嚴重、彌漫等各種原因無法進行手術治療，且藥物治療效果往往不理想。這部分CHD患者目前缺乏有效的干預措施，臨床上也被稱作“無選擇權”患者。
　　干細胞研究的進展為這類患者帶來了希望。近年來，大量基礎口臨床研究顯示，干細胞移植可以減少心肌細胞凋亡，促進新生血管形成，改善心室重構，提高心功能，顯示出良好的應用前景。其中間充質干細胞(mesenchymal stemcell

3、s，MSCs)因其來源廣泛，操作簡便，具有免疫豁免效應等優(yōu)勢而受到研究人員的廣泛青睞。現(xiàn)有的研究表明，MSCs治療急性心肌缺血安全有效。但MSCs在治療慢性心肌缺血方面的研究尚少。目前，國內外尚未見到在大動物模型上研究聯(lián)合移植MSCs治療CHD的報道。MSCs有多種來源，現(xiàn)有的研究多采用骨髓來源間充質干細胞(BM-MSCs)。但BM-MSCs具有取材有創(chuàng)傷，年齡較大供體的MSCs增殖能力有限等缺點。因此，研究人員開始探討多種其他來源MS

4、Cs治療心臟病的可行性。其中臍帶來源間充質干細胞(UC-MSCs)因其取材無創(chuàng)傷，無倫理限制，細胞增殖和分化能力強，能分泌多種促血管生成因子等優(yōu)勢，成為替代BM-MSCs的較為理想的細胞來源。目前已經(jīng)有大量采用UC-MSCs治療多種疾病的臨床前或臨床研究報道，包括肝硬化、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)等，但在心臟病的研究方面尚處于起步階段。目前尚未見到采用UC-MS

5、Cs治療CHD的研究報道。
　　因此，本研究擬建立豬慢性缺血性心臟病動物模型，通過冠脈結合兩次靜脈輸注的方式移植異體豬骨髓來源間充質干細胞(pig bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，pBM-MSCs)和人臍帶來源間充質干細胞(human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)進行干預，采用冠脈造影、心臟超聲、單光

6、子發(fā)射計算機斷層成像(single-photon emission computedtomography，SPECT)和病理組織學等方法綜合評價骨髓和臍帶來源MSCs移植對CHD的治療作用，從而為今后的臨床應用提供依據(jù)。
　　本研究首先采用Ficoll密度梯度法分離pBM-MSCs，相差顯微鏡觀察顯示，pBM-MSCs呈梭形，旋渦狀或魚尾狀生長。流式檢測結果表明，pBM-MSCs表達CD44、CD29、CD90，而CD14、CD3

7、4、CD45、CD166、HLA-DR表達呈陰性。誘導分化實驗發(fā)現(xiàn)，pBM-MSCs能夠分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞。
　　然后我們采用酶消化法分離hUC-MSCs，相差顯微鏡下觀察，細胞呈梭形，旋渦狀或平行排列，流式檢測結果顯示，細胞表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和HLA-ABC，而CD34、CD45、HLA-DR表達呈陰性。誘導分化結果顯示，hUC-MSCs可向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞的分化。

8、
　　最后我們著重探討了pBM-MSCs和hUC-MSCs對慢性缺血性心臟病大動物模型的治療作用。選取30只小型豬，將Ameroid動脈縮窄環(huán)置于豬左冠回旋支(left circumflex coronary artery，LCX)建立慢性缺血性心臟病動物模型，4周后通過冠脈造影和心電圖對模型進行評價;存活的20只動物隨機分為pBM-MSCs組(n=8)、hUC-MSCs組(n=6)和對照組(n=6)，治療組采用冠脈結合兩次靜脈輸

9、注的方式移植經(jīng)過CM-DiI標記的pBM-MSCs和hUC-MSCs進行干預，對照組則輸注生理鹽水。細胞移植前和移植后4周，冠脈造影檢測冠脈側枝循環(huán)，心臟超聲檢測心功能和心臟結構指標，SPECT檢測心肌血流灌注。動物處死后取心臟行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)染色計算梗死面積，并選取梗死邊緣區(qū)的組織制備病理切片，檢測心肌細胞纖維化、凋亡、新生血管形成

10、等情況，并觀察移植細胞的植入和轉歸。
　　建模后4周，存活的20只豬冠脈造影顯示LCX均完全閉塞，心電圖可見Ⅰ、AVL和（或）Ⅱ、Ⅲ、AVF和(或)V4-V6導聯(lián)ST段壓低和（或）T波改變。
　　細胞移植后4周，冠脈造影結果顯示:對照組和細胞治療組均有側枝血管形成，但與治療前相比，對照組Rentrop評分增加無統(tǒng)計學意義，而pBM-MSCs組和hUC-MSCs組結果則有顯著差異(p＜0.01)，表明細胞移植促進了側枝循環(huán)的形

11、成;與對照組相比，pBM-MSCs組和hUC-MSCs組側枝血管計數(shù)結果有顯著差異(P＜0.05)，但兩個細胞治療組之間無明顯差別。心電圖結果表明，pBM-MSCs和hUC-MSCs移植組心率(heart rate，HR)較治療前無明顯變化，而對照組HR明顯增加(P＜0.01)。心臟超聲:細胞治療組的左室射血分數(shù)(Leftventricular ejection fraction，LVEF)較治療前均有升高，pBM-MSCs組從53.9

12、1％±6.72％升至58.19±7.10％(p＜0.05)，hUC-MSCs組從56.12±2.86％升至61.32±3.23％(p＜0.05)，而對照組的LVEF較治療前下降;與對照組相比，細胞治療組LVEF的升高具有顯著差異(P＜0.05)，但pBM-MSCs組與hUC-MSCs組間相比無差異;與對照組相比，兩個細胞治療組的梗死區(qū)收縮期室壁增厚率(systolicthickening fraction in the infarcte

13、d left ventricular wall，WThF)升高均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);此外，對照組的左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume，LVESV)和左室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)較治療前均明顯增大(P＜0.05)，而pBM-MSCs組和hUC-MSCs組治療前后未見明顯改變。SPECT結果顯示:對

14、照組和細胞治療組心肌血流灌注均較治療前有所改善;但pBM-MSCs組(p＜0.01)和hUC-MSCs組(p＜0.05)改善較對照組明顯，且二者之間無顯著差異。
　　病理組織學結果顯示，TTC染色:pBM-MSCs組和hUC-MSCs組梗死面積分別為7.89±2.62％和8.35±1.88％，比對照組(14.52±4.85％)顯著減小(p＜0.05);HE染色:細胞移植組炎性評分顯著低于對照組(p＜0.05); Masson三色染

15、色顯示細胞移植組的膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)明顯小于對照組(p＜0.05);血管計數(shù):pBM-MSCs和hUC-MSCs移植組微血管密度顯著高于對照組(p＜0.05); TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)法檢測凋亡，pBM-MSCs組(11±3cells/100 cells)和hUC-MSCs

16、組(13±4 cells/100cells)凋亡的心肌細胞數(shù)量明顯少于對照組(24±3 cells/100 cells)(p＜0.01)。熒光顯微鏡下梗死邊緣區(qū)可見有CM-DiI標記的細胞，免疫熒光染色顯示pBM-MSCs組和hUC-MSCs組均可見移植后的MSCs部分分化為血管內皮細胞，未觀察到其向心肌細胞分化。RT-qPCR顯示，與對照組相比，pBM-MSCs組的促血管生成素(angiogenin，Ang)表達增高(p＜0.05)，

17、hUC-MSCs組的Ang(p＜0.01)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(p＜0.05)表達增高，而白介素-6(interleukin-6，IL-6)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、胸腺肽β4(thymosin beta4，Tβ4)的表達無顯著改變。
　　本研究成功分離培養(yǎng)了pBM-MSCs和hUC-MSCs;并