鋅鐵調(diào)控蛋白ZIP4在前列腺癌中的表達(dá)意義及作用機(jī)制研究.pdf

1、前言:
　　 前列腺癌是美國(guó)男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)調(diào)查顯示,2008年美國(guó)前列腺癌的新發(fā)病例是186,320例,而死于前列腺癌的病例數(shù)為28,660。隨著人均壽命的延長(zhǎng)和膳食結(jié)構(gòu)的改變,我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率正在逐年升高。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因改變,多因素作用的共同的結(jié)果,因而對(duì)前列腺癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究顯得至關(guān)重要。
　　 鋅是人體必須的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一,是體內(nèi)200多種含有鋅指結(jié)構(gòu)的酶和轉(zhuǎn)錄因

2、子保持活性并參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成及催化活性的必要組成部分,其在精液中能促進(jìn)精子的生成、成熟、激活、獲能過(guò)程,對(duì)男性生殖功能有很重要的作用。研究已經(jīng)表明鋅缺乏會(huì)導(dǎo)一系列疾病,包括致發(fā)育遲緩,DNA合成受損,免疫功能缺陷,及誘發(fā)皮肌炎等疾病,目前的研究進(jìn)一步顯示與鋅相關(guān)一些酶在缺氧,血管生成,細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移中扮有重要角色,表明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。
　　 近幾十年來(lái),盡管?chē)?guó)內(nèi)外在前列腺癌發(fā)病機(jī)制方面進(jìn)行了廣泛的臨床

3、和實(shí)驗(yàn)研究,然而其發(fā)病機(jī)理還不是很清楚。目前研究普遍認(rèn)為與其他軟組織相比較,前列腺組織具有特異性的聚集高濃度鋅的能力,此聚集高濃度的鋅離子功能是由前列腺組織外周帶具有高度特異性的腺分泌上皮細(xì)胞所完成的而總所周知前列腺的外周帶是前列腺癌的最好發(fā)部位。近50年的研究已經(jīng)一致表明正常前列腺外周帶與前列腺癌外周帶鋅含量分別為為3000-4500,400-800(nmols/g,濕重),與正常前列腺組織相比,前列腺癌組織中鋅濃度下降達(dá)66.5%,

4、而與正常前列腺外周帶相比,鋅含量下降了70-85%,同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)在前列腺癌發(fā)生的早期,組織的鋅已經(jīng)丌始下降,而近期又有多個(gè)研究顯示在在膽囊癌,肝癌及前列腺癌患者的血液中鋅離子辦顯著下降,因而推測(cè)鋅在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中有可能起到很重要的作用。
　　 新近發(fā)現(xiàn)的與鋅調(diào)節(jié)相關(guān)的兩種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,一個(gè)是由SLC30基因編碼的ZnT蛋白家族,一個(gè)是由SLC39基因編碼的ZIP蛋白家族,ZnT家族主要是將鋅離子轉(zhuǎn)出細(xì)胞或促使鋅進(jìn)入細(xì)胞

5、內(nèi)的囊泡從而降低細(xì)胞內(nèi)鋅的濃度,而鋅鐵調(diào)控蛋白(ZRT,IRT-likeprotein,ZIP)家族主要功能是將鋅離子轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)或促進(jìn)囊泡內(nèi)鋅的釋放增加細(xì)胞內(nèi)鋅的濃度,兩者共同作用維持細(xì)胞內(nèi)鋅離子的穩(wěn)定。鋅鐵調(diào)控蛋白與許多惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān),其在乳腺癌和胰腺癌進(jìn)展中作用已經(jīng)得到部分證實(shí)。目前Desouki等的研究認(rèn)為ZIP1,ZIP2和ZIP3在前列腺癌中表達(dá)均下調(diào)同時(shí)伴鋅水平下降,表明ZIP1,ZIP2和ZIP3可能是一個(gè)抑癌基因。Z

6、IP4是ZIP家族的一個(gè)新成員,由SLC39A4基因編碼合成,其在腸道鋅的吸收和囊泡中鋅的釋放中起到重要的作用。研究顯示ZIP4的表達(dá)缺失與肌皮炎相關(guān),其過(guò)表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生有著密切關(guān)系。但到目前為止,ZIP4在前列腺癌中的作用及其生物學(xué)機(jī)制還不是很清楚。
　　 本研究旨在明確ZIP4在前列腺癌組織中表達(dá)情況,并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、檢測(cè)Z

7、IP4在前列腺癌組織中mRNA和蛋白的表達(dá)情況,統(tǒng)計(jì)分析ZIP4基因的表達(dá)情況與前列腺癌臨床病理特征間的關(guān)系,分析ZIP4基因表達(dá)的臨床意義。
　　 (1).免疫組化檢測(cè)30例前列腺癌和30例前列腺增生組織中ZIP4的表達(dá)情況;
　　 (2).利用Real-timeRT-PCR和Westernblot法檢測(cè)前列腺組織中ZIP4的mRNA和蛋白表達(dá)情況;
　　 2、根據(jù)前期試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果構(gòu)建穩(wěn)定ZIP4過(guò)表達(dá)細(xì)胞株(

8、DU145-ZIP4),觀察ZIP4過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。
　　 (1).MTT法檢測(cè)ZIP4過(guò)表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞增殖能力的影響;
　　 (2).Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)ZIP4過(guò)表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞侵襲能力的影響;
　　 (3).Transwell遷移試驗(yàn)及劃痕試驗(yàn)檢測(cè)ZIP4過(guò)表達(dá)對(duì)DU145細(xì)胞遷移能力的影響:
　　 3、利用RNA干擾技術(shù),將ZIP4sh

9、RNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前列腺22RV1細(xì)胞,觀察RNA干擾對(duì)22RV1細(xì)胞增殖,侵襲、遷移能力及MMP-2的影響。
　　 (1).MTT法檢測(cè)干擾后22RV1細(xì)胞的增殖活性;
　　 (2).Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)干擾后細(xì)胞的侵襲能力;
　　 (3).Transwell遷移試驗(yàn)檢測(cè)干擾后細(xì)胞的遷移能力;
　　 (4).Elisa法檢測(cè)干擾后22RV1細(xì)胞MMP-2的分泌水平;
　　 結(jié)果:
　

10、　 1、免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示ZIP4在前列腺癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為13%,而在前列腺增生組織中的陽(yáng)性率為93.3%,差異顯著(P＜0.05)。Real-timeRT-PCR及Westernblot顯示ZIP4在前列腺癌組織中表達(dá)顯著下降,與前列腺增生組織相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ZIP4mRNA在前列腺增生組織中的平均表達(dá)含量為前列腺癌組織中的49.1倍,在不同分級(jí)的前列腺癌之問(wèn)ZIP4mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(X2

11、=0.589,P=0.745),Gleason評(píng)分與ZIP4mRNA的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性(r=0.012,P=0.968)。
　　 2、RealTimeRT-PCR及WesternBlot檢測(cè)ZIP4在22RVl,DU145,PC-3三種前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)量,結(jié)果顯示:ZIP4在22RV1中表達(dá)量最高,PC-3居中,DU145最少。成功構(gòu)建ZIP4過(guò)表達(dá)細(xì)胞株DU145-ZIP4。應(yīng)用MTT、Transwell侵襲試驗(yàn)、Tra

12、nswell遷移試驗(yàn)機(jī)劃痕試驗(yàn)分別檢測(cè)其增殖、侵襲和遷移能力,結(jié)果顯示ZIP4過(guò)表達(dá)后DU145細(xì)胞的增殖及侵襲能力均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而遷移能力未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05)。
　　 3、利用前期檢測(cè)結(jié)果成功構(gòu)建22RV1-shZIP4細(xì)胞株,應(yīng)用MTT、Transwell侵襲試驗(yàn)、Transwell遷移試驗(yàn)和Elisa分別檢測(cè)列腺癌22RV1-shZIP4,22RV1-shV及22RV1細(xì)胞的增殖、

13、侵襲、遷移能力及MMP-2的分泌量的變化,結(jié)果顯示干擾后22RV1-shZIP4細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著提高,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),其細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2的分泌量顯著上升,與22RVl組相比,增加了57.35%。差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、ZIP4在mRNA及蛋白水平,在前列腺癌中的表達(dá)含量與其在前列腺增生組織的表達(dá)量相比均顯著下降,有可能成為前列腺癌的一個(gè)診斷指標(biāo)。