EB病毒GPCR蛋白BILF1調控ICAM-1表達的分子機制研究.pdf

1、背景：
　　 G蛋白偶聯(lián)受體(GProtein-CoupledReceptor，GPCR)是一個龐大的受體家族，通過G蛋白與效應分子偶聯(lián)，完成跨膜信號轉導，實現(xiàn)多種生理或藥理效應。除真核生物外，許多病毒所編碼的病毒蛋白也具有GPCR的特征，如具有7次疏水跨膜區(qū)域、氨基末端存在糖基化位點、胞內區(qū)存在磷酸化位點，氨基末端及胞外環(huán)中存在保守的半胱氨酸等。許多體內外研究提示，病毒所編碼的GPCR蛋白對病毒復制以及病毒在自然宿主中所誘導的

2、病理生理效應具有重要調控作用。例如，鼠巨細胞病毒GPCR蛋白M33的缺陷將導致病毒不能播散至感染鼠的唾液腺部位;同時相對于野生型病毒，M33缺陷性的鼠巨細胞病毒對免疫功能底下小鼠的毒性更低;而該病毒另一種GPCR基因-M78的缺陷使鼠巨細胞病毒無論是在免疫功能健全還是免疫功能底下的小鼠中，都以一更低的水平復制和/或播散。γ2-皰疹病毒亞科的卡波氏肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)編碼的G蛋白偶聯(lián)受體ORF74也被認為在卡波氏肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程

3、中起著關鍵作用。
　　 隸屬于γ-皰疹病毒亞科的EB病毒亦編碼一種GPCR蛋白-BILF1，BILF1是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的EB病毒GPCR蛋白。迄今為止，Pubmed僅收錄5篇有關BILF1的文獻。這些研究顯示，BILF1屬于一新型G蛋白偶聯(lián)受體的亞家族，定位于漿膜系統(tǒng)，組成性激活Gai蛋白并借助其傳遞生物信號;BILF1還可通過下調MHCI類分子在宿主細胞膜表面的表達，在病毒免疫逃逸過程中發(fā)揮極其重要的作用。具有GPCR活性的B

4、ILF1是EB病毒的立早蛋白之一，已知其調控ERK，NF-кB等多條信號通路，參與病毒的裂解性復制，而它對宿主細胞更多調控作用機制有待進一步發(fā)掘。
　　 EB病毒在人群中廣泛感染(90-95％)，其感染的一個重要特征是病毒能在機體能完成反復多次的潛伏——裂解期轉換。EBV潛伏在外周血的記憶性B細胞中，當遇到特定信號的刺激，潛伏在記憶性B細胞中的EBV被激活，釋放出的病毒最終在口咽部上皮細胞中發(fā)生爆發(fā)性復制?？梢?，攜帶EBV的B細

5、胞在循環(huán)系統(tǒng)中游走、遷移、最后在效應部位定居和大量復制。EBV在機體中的生活史依賴于細胞粘附分子的作用。同時EBV能轉化B細胞與B細胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等多種腫瘤有關。而許多粘附分子介導了腫瘤的惡性行為。
　　 細胞間粘附分子(intercellularadhesionmolecule)ICAM-1以其介導異質粘附的功能受到研究人員的關注。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，是調節(jié)異質黏附的重要因素，它在一些惡性腫瘤，如惡性黑色

6、素瘤、胃癌、結腸癌、腎癌等腫瘤細胞中過度表達，與腫瘤轉移和預后密切相關。我們在研究中發(fā)現(xiàn)BILF1可在蛋白水平上調ICAM-1分子的表達，在此基礎上，我們設計了相關實驗，進一步分析BILF1對ICAM-1表達調控作用及機制。
　　 目的：
　　 分析EB病毒立早蛋白BILFI對細胞間粘附分子ICAM-1表達的上調作用，并初步探討其調控信號及機制。
　　 方法：
　　 首先，我們在人B淋巴瘤細胞系Raji中

7、構建了TPA/SB誘導EBV激活的細胞模型并分析了BILF1在EBV激活過程中的表達模式。我們同時構建了BILFI的真核表達載體并通過電穿孔轉染技術外源轉入BILF1，應用Westembolt、Real-timePCR、雙熒光素酶報告載體實驗和特異性siRNA干擾技術，分別在蛋白水平和mRNA水平分析了BILF1對細胞間粘附分子ICAM-1表達水平的影響并分析其調控機制。為進一步分析BILFl蛋白質二級結構EKT結構域與BILF1生物學

8、功能之間的關系，我們構建了BILFI-K122A突變體，并通過Westembolt、雙熒光素酶報告載體實驗和免疫熒光技術，在蛋白水平、mRNA水平及亞細胞定位等方面進一步探討B(tài)ILFI的功能與作用方式。
　　 結果：
　　 研究結果顯示，BILF1是EBV立早蛋白之一，在TPA/SB誘導的EBV激活模型中，BILF1表達模式與立早轉錄因子Zta的表達完全一致;過表達BILF1在mRNA和蛋白水平上調粘附分子ICAM-l分

9、子的表達;BILF1可激活ICAM-1的啟動子活性，提示BILF1調控了ICAM-1的轉錄。NF-кB和AP-1是ICAM-1啟動子上重要的反應元件。通過報告載體分析發(fā)現(xiàn)，過表達BILFI可直接上調AP-l和NF-кB報告載體活性，且對AP-1的激活更顯著，呈劑量依賴性。提示BILF可能通過激活NF-кB和AP-1上調ICAM-1啟動子活性，從而影響ICAM-1轉錄及表達。進一步通過WB分析實驗觀察到過表達BILF1在上調ICAM-I表

10、達的同時誘導p65的磷酸化，上調NF-кB靶基因Bcl-XL和IкBα表達，同時上調AP-1成員c-Jun磷酸化和c-fos水平。用MEKl抑制劑阻斷ERK通路的活化，觀察到BILFI的AP-1的激活和ICAM-I的上調作用只是部分受到的影響。提示BILF1對ICAM-1的上調作用依賴于其它通路。BILF1的GPCR活性依賴于其分子中的EKT結構域，我們構建了EKT功能缺陷的BILF1突變體K122A，通過報告載體活性分析及WB實驗觀察

11、到EKT功能域缺陷后部分的抑制了BILF1對AP-1的激活，提示BILF1對AP-1的激活部分依賴于‘EKT結構域。最后我們通過，RNA干擾實驗結果證實，特異性敲低BILF1可抑制EBV激活所誘導的ICAM-1表達上調。
　　 結論：
　　 具有GPCR活性的EB病毒立早蛋白BILF1可在mRNA和蛋白水平上調細胞間粘附分子ICAM-1表達，這一效應主要是通過不完全依賴于ERK的AP-1信號通路實現(xiàn)的。BILF1上調IC