電壓敏感鈉離子通道抑制劑的篩選及其表達(dá).pdf

1、分布于神經(jīng)系統(tǒng)的電壓敏感鈉離子通道與疼痛、癲癇等神經(jīng)疾病有關(guān)，使用合適的離子通道抑制劑能夠有效的緩解慢性疾病的困擾。具有ICK模型的小分子多肽是潛在的鈉離子通道抑制劑。因其具有耐酸堿、抗熱及耐受蛋白酶的特點(diǎn)，可作為緩解疼痛的藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)使用。
　　從天然毒素中去尋找潛在的鈉離子通道抑制劑，是一件耗時(shí)耗力的工作。天然毒素海南Ⅳ是典型的ICK模型分子，含有三對(duì)二硫鍵。本研究在保持海南毒素Ⅳ的ICK分子結(jié)構(gòu)基本不變的前提下對(duì)其進(jìn)行改造，

2、隨機(jī)化其中的五個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)隨機(jī)5肽cDNA文庫(kù)(R5)。
　　酵母雙雜交是研究蛋白質(zhì)間相互作用且具有高通量篩選特點(diǎn)的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)基于酵母雙雜交的方法，選用鼠電壓敏感鈉離子通道1.3 DomainⅡ膜外區(qū)上的S1-S2為誘餌蛋白，對(duì)隨機(jī)五肽文庫(kù)進(jìn)行高通量的篩選。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，排除假陽(yáng)性的現(xiàn)象，得到兩個(gè)rNav1.3DⅡ的S1-S2的潛在抑制劑，分別命名為R1和R2。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R1、R2無(wú)自激活作用。
　　通過(guò)

3、分子模擬發(fā)現(xiàn)，R1、R2上分別有一處殘基可能在酵母雙雜交水平上起關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，原本在酵母雙雜交水平上與rNav1.3DⅡ的S1-S2檢測(cè)不到相互作用的敬釗毒素Ⅲ，在替換了來(lái)自R1或R2的關(guān)鍵殘基后結(jié)果呈陽(yáng)性。
　　為了進(jìn)一步對(duì)篩選到的潛在抑制劑R1、R2進(jìn)行研究，需要獲得蛋白實(shí)體。小分子多肽實(shí)體的獲得一般有兩種方法可選，化學(xué)合成或者是原核表達(dá)。但化學(xué)合成存在成本高、蛋白活性與天然活性不一致等風(fēng)險(xiǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)