貴陽腐霉侵染致倦庫蚊幼蟲初步研究及貴陽腐霉EGFP轉化株的構建.pdf

1、目的:（1）觀察貴陽腐霉侵染蚊幼蟲的物理過程并檢測侵染后免疫相關基因mRNA表達水平的變化;（2）構建含增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的雙元表達載體,利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法,獲得穩(wěn)定表達EGFP的貴陽腐霉轉化株;（3）探討根癌農桿菌介導貴陽腐霉的遺傳轉化及其影響因素,并優(yōu)化其轉化體系。
　　方法:（1）以二齡致倦庫蚊幼蟲為實驗材料進行生物測定,光學顯微鏡下觀察侵染過程。以正常致倦庫蚊四齡幼蟲為對照,采用SYBR Green

2、Ⅰ實時熒光定量PCR檢測四齡蚊幼蟲感染貴陽腐霉早期cecropin、PPO、transferrin、defensin、gambicin、serpin表達水平的變化。（2）采用PCR、酶切、去磷酸化、酶連、轉化等多種分子生物學手段,利用潮霉素抗性基因hph為篩選標記,以雙元載體pPK2為基本骨架,將增強型綠色熒光蛋白基因egfp置于絲狀真菌組成型啟動子PgpdA和色氨酸C終止子TtrpC之間,構建組成性表達egfp的載體pPK2-EGFP

3、,以貴陽腐霉菌絲體為受體材料,利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法,轉入貴陽腐霉表達,并對轉化菌株進行傳代培養(yǎng),觀察轉化菌株的遺傳穩(wěn)定性以及對蚊蟲的毒力改變;（3）對根癌農桿菌預培養(yǎng)是否加入乙酰丁香酮（AS）、農桿菌與菌絲體共培養(yǎng)的溫度(24、25、26、27、28℃)、共培養(yǎng)時間(24、36、48、72、96 h)、共培養(yǎng)中乙酰丁香酮的濃度(100、200、300、400μmol/L)等因素進行研究,觀察上述條件下根癌農桿菌轉化貴陽腐霉的效

4、率。
　　結果:（1）在光學顯微鏡下,觀察到貴陽腐霉游動孢子附著于蚊幼蟲體壁,并萌發(fā)出芽管,鉆入蚊幼蟲體內生長,然后穿出體外導致寄主死亡并產生孢子囊,釋放游動孢子的過程。在貴陽腐霉感染早期的四齡致倦庫蚊幼蟲免疫相關基因表達水平較正常組均上調。其中defensin和gambincin表達上調最為顯著，分別上調了165.880和48.101倍，而transferrin僅上調了1.971倍;（2）成功構建了一含有egfp表達元件的雙元載

5、體,并轉入貴陽腐霉中穩(wěn)定表達,在熒光顯微鏡下觀察到菌絲體有綠色熒光產生;（3）根癌農桿菌轉化貴陽腐霉的條件：農桿菌預培養(yǎng)中加入200μmol/L AS、農桿菌與貴陽腐霉共培養(yǎng)溫度26℃、共培養(yǎng)時間72 h、共培養(yǎng)中AS濃度200μmo1/L。
　　結論:（1）通過光學顯微鏡下觀察貴陽腐霉侵染致倦庫蚊幼蟲的過程,證實了游動孢子為貴陽腐霉的侵染單位,可以通過游動孢子萌發(fā)芽管的方式直接侵入蚊幼蟲,較直觀地表現(xiàn)了貴陽腐霉對蚊幼蟲的侵染能力