P2X4、NALP3表達變化與糖尿病腎病腎間質炎癥損傷的關系.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常見且最嚴重的并發(fā)癥，是導致終末期腎衰竭的主要原因。近年研究表明，炎癥在糖尿病腎病發(fā)病中具有重要作用。白介素1(Interleukin1，IL-1)家族細胞因子包括IL-1β、IL-18、IL-33等，是重要的促炎細胞因子，主要介導感染、應激、組織損傷等引起的免疫反應。研究發(fā)現，DKD患者腎間質中活性IL-1β、IL-18等促炎細胞因子明顯增加，提示這些炎癥細

2、胞因子可能參與DKD的發(fā)生發(fā)展，但DKD時這些促炎細胞因子是如何產生并且活化的機制并不清楚。
　　 目前認為，IL-1家族細胞因子前體分子活化后才能發(fā)揮生物學效應，而這一活化過程必須依靠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)的剪切作用才能完成，NALP3(Cryopyrin)是NALP3炎性體最重要的的組成部分之一，屬于NLRs(NOD like receptors，NLRs)家族成員，負責識別危險信號，活化Caspas

3、e-1，剪切IL-1家族前體，使之成為有活性的促炎細胞因子如IL-1β、IL-18、IL-33等，進而引起一系列的炎癥反應。
　　 近年來NALP3在腎臟疾病中的病理生理作用已開始受到關注，研究發(fā)現小鼠腎臟缺血再灌注(I/R)模型中，NALP3-/-和ASC-/-小鼠腎組織炎癥反應和腎功能損傷顯著減輕，小鼠死亡率顯著降低；在單側輸尿管梗阻模型中，NALP3炎性體活化與IL-1β產生增加相關，提示NALP3在非免疫因素介導的腎組織

4、炎癥反應中具有重要作用；最近研究發(fā)現，高糖誘導NALP3-/-小鼠胰島β細胞產生IL-1β顯著降低，推測腎臟NALP3炎性體是否參與了高糖刺激腎小管上皮細胞產生IL-1β、IL-18等，進而引起腎間質炎癥損害，而腎小管上皮細胞如何將高糖刺激信號傳遞到胞漿內進而激活NALP3炎性體尚不清楚。
　　 研究報道，ROS抑制劑APDC或NADPH氧化酶抑制物DIP均可抑制高糖激活胰島β細胞NALP3炎性體及IL-1β的產生；格列本脲通過

5、抑制細胞內K+外流而抑制高糖對NALP3炎性體的激活作用，提示氧應激和細胞內低鉀可能是高糖激活胰島β細胞NALP3炎性體的重要途徑。P2Xs(Purinergic receptor X，P2Xs)是以核苷酸為激動劑的離子通道型嘌呤受體，當細胞外刺激信號(如ATP)作用于效應細胞時P2Xs發(fā)生構象變化，促進細胞外鈣離子內流和鉀離子外流，引起細胞內低鉀；P2Xs還介導ATP引起的巨噬細胞ROS產生和IL-1β等炎癥細胞因子釋放，但目前未見高

6、糖通過激活P2Xs活化NALP3的文獻報道。由于P2Xs激活的下游事件如細胞內低鉀和ROS增多，均是NALP3炎性體活化途徑中的重要環(huán)節(jié)，并且P2Xs的重要成員P2X4在腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞都有表達，此外，高糖負荷和ATP可上調系膜細胞P2X4表達參與糖尿病腎病腎小球硬化的發(fā)生，因此我們推測，腎小管上皮細胞可能通過P2X4感受高糖信號的刺激而激活NALP3炎性體，促進活性IL-1β和IL-18等的產生，進而引起腎小管間質炎癥反

7、應，放大高糖引起的炎癥反應瀑布，最終導致糖尿病腎病腎間質炎癥反應。為此，本課題針對DKD患者腎小管上皮細胞P2X4、NALP3、IL-1β、IL-18的表達規(guī)律及其變化關系進行了研究，為下一步研究其機制奠定理論基礎，旨在為揭示糖尿病腎病腎小管間質炎癥反應的機制提供新的科學依據。
　　 一、實驗方法
　　 1.研究對象及分組根據1999年WHO、IDF公布的糖尿病以及Mogensen糖尿病腎病診斷標準[1]，選取2010年

8、9月至2011年10月第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腎臟內科收治的經臨床和腎活檢確診為2型糖尿病腎病病例30例(尿蛋白>500mg/d或SCr>120μmol/L)，其中男性12例，女性18例，年齡40-68歲，(平均47.93±7.05歲)；對照組為泌尿外科腎臟錯構瘤切除術或腎移植術病例(尿蛋白<500 mg/d或SCr<120μmol/L)10例，其中男性6例，女性4例，年齡40-65歲，(平均50.60±9.40歲)，并留取腎錯構瘤切除后或

9、腎移植術后經病理診斷為正常的腎組織。所有對象均排除糖代謝異常、吸煙、高血壓、肥胖等干擾因素。
　　 收集標本時均取得患者本人及家屬的知情同意，所選患者均排除糖尿病急性并發(fā)癥、泌尿系感染、嚴重心、肝、腎功能不全、以及風濕病、惡性腫瘤等系統(tǒng)性疾病。
　　 2.檢測指標及方法
　　 于術前收集對照組患者血、尿標本，腎活檢前一天收集DKD患者的血、尿標本，常規(guī)生化方法檢測血清總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白膽固醇(LDL

10、)、空腹血糖、24小時尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)，測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、計算體重指數(BMI)、估算腎小球濾過率(eGFR)，按照Cockcroft-Gault計算公式：eGFR(mL/min per1.73 m2)=(140-age)×BW(kg)/[72×Scr(mg/dl)]×0.85(if female)；免疫組化方法檢測對照組及DKD組腎小管上皮細胞P2X4、NALP3、IL-1β及IL-18的表達變化規(guī)

11、律；激光共聚焦技術檢測P2X4、NALP3、IL-1β及IL-18的表達變化關系；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測兩組患者尿液中IL-1β、IL-18的水平。
　　 一、實驗結果
　　 1.一般情況
　　 與對照組相比，DKD組患者24小時尿微量白蛋白、空腹血糖、SBP、DBP、總膽固醇、LDL膽固醇、甘油三酯及BMI顯著增高(P<0.05)，eGFR顯著降低(P<0.05)。
　　 2.NALP3、I

12、L-1β、IL-18在腎小管上皮細胞的表達情況及其與腎間質損傷的相關性
　　 免疫組化結果顯示對照組腎小管上皮細胞胞漿NALP3呈低水平的表達，IL-1β、IL-18基本不表達；DKD組患者腎小管上皮細胞胞漿NALP3、IL-1β、IL-18表達顯著增加(P<0.05)；相關分析表明：DKD患者腎小管上皮細胞NALP3、IL-1β、IL-18表達與腎間質炎癥呈顯著正相關關系(r=0.66，r=0.55，r=0.83，P<0.01

13、)、與腎間質纖維化呈顯著正相關關系(r=0.65，r=0.50，r=0.81，P<0.01)、與腎小管萎縮呈顯著正相關關系(r=0.63，r=0.56，r=0.82，P<0.01)，與eGFR呈顯著負相關關系(r=-0.73，r=-0.65，r=-0.58，P<0.01)；激光共聚焦結果顯示DKD組患者NALP3與IL-1β、IL-18分別共表達于腎小管上皮細胞胞漿。
　　 3.P2X4在腎小管上皮細胞的表達情況及其與腎間質損傷

14、的相關性
　　 免疫組化結果顯示對照組腎小管上皮細胞胞漿P2X4呈低水平的表達，DKD組患者腎小管上皮細胞胞漿P2X4表達顯著增加(P<0.05)；相關分析表明：DKD患者腎小管上皮細胞P2X4與腎間質炎癥呈顯著正相關關系(r=0.82，P<0.01)，與腎間質纖維化呈顯著正相關關系(r=0.80，P<0.01)，與腎小管萎縮呈顯著正相關關系(r=0.80，P<0.01)，與eGFR呈顯著負相關關系(r=-0.58，P<0.01

15、)；激光共聚焦結果顯示DKD組患者P2X4與NALP3、IL-1β、IL-18分別共表達于腎小管上皮細胞胞漿。
　　 4.ELISA檢測尿中IL-1β、IL-18水平變化
　　 結果顯示，DKD患者尿IL-1β、IL-18水平較對照組顯著增高(P<0.05)。
　　 三、結論
　　 1.DKD患者腎小管上皮細胞P2X4、NALP3、IL-1β、IL-18表達與腎間質損傷及腎功能改變的相關性表明腎間質炎癥反