WWTR1對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　近年來,肺癌在世界范圍內的發(fā)病率和死亡率均明顯上升,已對人類健康形成極大威脅。探討肺癌發(fā)病及進展機制,據(jù)此發(fā)現(xiàn)有效的治療肺癌的靶向藥物靶點以及對肺癌靶向藥物療效的評估已成為目前研究的熱點和難點。
　　Hippo通路在細胞增殖與凋亡的調節(jié)中起關鍵作用,已證實其在胚胎發(fā)育,組織器官形成以及自身穩(wěn)態(tài)保持等方面都具有重要作用,最近研究發(fā)現(xiàn)Hippo通路功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。WWTR1(WW domain c

2、ontaining transcription regulator1, WW域轉錄調節(jié)因子1)作為Hippo通路下游的效應分子能夠與多種轉錄因子相互作用,發(fā)揮生物學功能。已有研究顯示W(wǎng)WTR1是一個癌基因,并可促進乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種惡性腫瘤的進展,但WWTR1調節(jié)肺癌增殖和凋亡分子機制仍不清楚。本論文旨在明確WWTR1在非小細胞肺癌組織中的表達與臨床病理因素的關系,并進一步探討WWTR1對肺癌細胞增殖和凋亡能力的影響及其可能的調

3、節(jié)機制。
　　方法:
　　(1)選取105例非小細胞肺癌和10例正常肺組織標本,應用免疫組織化學的方法檢測了WWTR1的表達情況。
　　(2)應用統(tǒng)計學軟件分析WWTR1表達與非小細胞肺癌臨床病理因素的關系。
　　(3)應用Western blot和Real-time PCR檢測了正常支氣管上皮細胞HBE和一系列肺癌細胞系(LK2、H1299、H460、H446、A549)中的WWTR1的蛋白和mRNA表達情況。

4、
　　(4)選取高表達WWTR1的細胞系A549和低表達WWTR1的HBE細胞,通過轉染外源基因或siRNA干擾進行基因調控:在A549細胞系中轉染W(wǎng)WTR1 siRNA,下調WWTR1表達;在HBE細胞中轉染W(wǎng)WTR1質粒,上調WWTR1表達。
　　(5)采用MTT細胞增殖實驗分別檢測轉染W(wǎng)WTR1的HBE細胞和干擾了WWTR1的A549細胞的增殖能力的變化。
　　(6)用紫杉醇處理基因調控后的HBE和A549細胞,

5、應用Annexin V/PI流式雙染技術檢測細胞凋亡能力的變化。
　　(7)采用流式細胞周期術分別檢測轉染W(wǎng)WTR1的HBE細胞和干擾WWTR1的A549細胞的細胞周期變化。
　　(8)使用Western blot和Real-time PCR篩選WWTR1調節(jié)肺癌細胞增殖、凋亡的作用靶點。
　　結果:
　　(1)免疫組化染色結果顯示W(wǎng)WTR1主要在肺癌組織的細胞核或細胞漿中表達,也有部分肺癌組織中存在WWTR1的

6、核漿共表達。在檢測的105例非小細胞肺癌組織中,有44例呈WWTR1陽性表達,其陽性表達率為41.90％(44/105)。
　　(2)分析WWTR1在肺癌組織中陽性表達與各種臨床病理因素的關系。統(tǒng)計結果顯示,WWTR1陽性表達與TNM分期顯著相關(I期vsII+III期;25.71%vs50.00%;p=0.0174);WWTR1陽性表達與腫瘤大小顯著相關(T1+T2 vs T3;36.59%vs60.87%;p=0.0370);

7、另外WWTR1陽性表達與淋巴結轉移顯著相關(N0 vs N1+N2;32.65% vs50.00%;p=0.0723)。WWTR1的陽性表達與肺癌患者的年齡(p=0.7060),性別(p=0.1510),組織類型(p=0.4608),分化程度(p=0.9166)均無顯著相關。
　　(3)應用Western blot和Real-time PCR檢測了支氣管上皮細胞HBE和一系列肺癌細胞系(LK2、H1299、H460、H446和A5

8、49)中WWTR1的表達水平,結果發(fā)現(xiàn)WWTR1在肺癌細胞系中的表達水平明顯高于正常的支氣管上皮細胞系HBE。尤其是在A549細胞系中呈明顯的高表達。
　　(4)通過MTT細胞增殖實驗檢測WWTR1對細胞增殖能力的影響。在A549細胞中通過WWTR1特異性siRNA下調WWTR1后,細胞增殖水平明顯下降;而在過表達WWTR1的HBE細胞系中,細胞增殖能力顯著增加。
　　(5)采用Annexin V/PI流式雙染細胞術,觀察W

9、WTR1對經(jīng)過紫杉醇(10nmol/L,24hours)處理的肺癌細胞的凋亡的影響。結果發(fā)現(xiàn)在敲除WWTR1后,A549肺癌細胞的早期凋亡水平和晚期凋亡水平明顯升高,然而在WWTR1過表達的HBE細胞系中,細胞的凋亡水平明顯被抑制。
　　(6)流式細胞周期檢測分析顯示,在 WWTR1表達下調后,G0/G1期細胞比例升高而S期細胞比例降低;相反,在WWTR1表達上調后,G0/G1期細胞比例降低而S期細胞比例升高。
　　(7)運

10、用 Real-time PCR篩查潛在的與增殖和凋亡相關基因的表達,包括CyclinA,CyclinD1,CyclinE,CTGF,c-Myc, Bcl-2, Bcl-xl, XIAP和 Bax。結果顯示,敲除WWTR1降低Cyclin A和CTGF的mRNA和蛋白表達;而過表達WWTR1增加Cyclin A和CTGF的mRNA和蛋白表達。提示W(wǎng)WTR1對肺癌細胞增殖和凋亡的調節(jié)依賴或部分依賴于CyclinA和 CTGF。另外,過表達W

11、WTR1可減少Caspase3剪切;而干擾WWTR1可促進Caspase3剪切。
　　結論:
　　(1)WWTR1在非小細胞肺癌組織中存在過表達,并且WWTR1陽性表達與肺癌TNM分期、腫瘤大小以及淋巴結轉移成正相關。
　　(2)WWTR1在肺癌細胞系中存在過表達;WWTR1促進肺癌細胞增殖。
　　(3)WWTR1抑制紫杉醇誘導的肺癌細胞的凋亡。
　　(4)WWTR1可促進肺癌細胞由G1期向S期轉變。