SREBP-DDAH-ADMA途徑在高胰島素血癥所致血管內(nèi)皮損傷中的作用.pdf

1、本文從以下三部分進行了闡述。
　　第一章高胰島素血癥對冠心病患者血漿非對稱性二甲基精氨酸水平的影響。
　　目的:2型糖尿病(T2DM)疾病早期或使用胰島素治療期間均有高胰島素血癥，高胰島素血癥促進動脈粥樣硬化，是冠心病的獨立危險因素。血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)，內(nèi)皮來源的NO減少是其損傷的特征性表現(xiàn)，非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)是內(nèi)源性NOS抑制劑，減少NO合成，為心血管死亡預測因子。本章研究擬探討高胰島素

2、血癥對人體血漿ADMA的影響，為高胰島素血癥損傷內(nèi)皮提供依據(jù)。
　　方法:來自2009年9月～2010年5月中南大學湘雅醫(yī)院心內(nèi)科冠心病患者及體檢中心健康人群，共89人，分為三組:(1)正常對照組(Con):30例;(2)冠心病組(CAD):30例;(3)冠心病合并高胰島血癥組(CAD+Hins):29例。測身高、體重，計算體重指數(shù)(BMI);測腰圍、臀圍，計算腰/臀(WHR);測血壓。采集過夜空腹10 h靜脈血5mL，全自動生化

3、分析儀測定:肝功能、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr); AXSYM全自動標記免疫化學發(fā)光儀檢測空腹胰島素(Fins)、餐后2h胰島素(2h-PIns)。
　　結(jié)果:1.CAD+Hins組、CAD組、Con組三組間性別、年齡、血壓、肝功能無顯著性差異，存在可比性。2

4、.CAD+Hins組BMI，F(xiàn)PG，F(xiàn)ins，2h-Pins，HOMA-IR均顯著高于CAD組和Con組(P＜0.05)，CAD組上述指標顯著高于Con組(P＜0.05)。3.各組間TC無統(tǒng)計學差異，CAD+Hins組和CAD組的TG、HDL-C以及UA、Cr、BUN均顯著高于Con組(P＜0.05); CAD組LDL-C顯著高于Con組(P＜0.05); CAD+Hins組UA顯著高于CAD組(P＜0.05)。4.CAD+Hins組A

5、DMA、hs-CRP水平顯著高于CAD組和Con組(P＜0.05); CAD組ADMA顯著高于Con組(P＜0.05)。5.未發(fā)現(xiàn)血漿ADMA與其他生化指標的相關性。
　　結(jié)論:1.高胰島素血癥加重已患冠心病患者的糖、脂代謝與尿酸代謝障礙。2.高胰島素血癥引起冠心病患者血漿ADMA水平進一步升高，是內(nèi)皮功能損傷加重的表現(xiàn);3.合并高胰島素血癥的冠心病患者血漿hs-CRP水平升高，提示高胰島素血癥與慢性炎癥有關。
　　第二章高

6、胰島素血癥大鼠血漿ADMA/NO和主動脈SREBP、DDAH變化及與內(nèi)膜損傷關系。
　　目的:第一章臨床研究發(fā)現(xiàn)合并高胰島素血癥的冠心病患者血漿ADMA水平顯著高于單純冠心病患者與健康對照，提示高濃度胰島素對內(nèi)皮的損傷作用。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)是水解ADMA的關鍵酶，調(diào)節(jié)體內(nèi)ADMA濃度。DDAH啟動子區(qū)含有能與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)相結(jié)合的膽固醇調(diào)節(jié)組件(SRE)，提示SREBPs可結(jié)合SRE調(diào)節(jié)D

7、DAH的表達;研究表明:高胰島素有促進SREBPs表達的作用。探討高胰島素血癥SD大鼠主動脈SREBPs、DDAH的表達有助于進一步闡述高胰島素損傷內(nèi)皮的具體機制。本章研究擬建立高胰島素血癥SD大鼠動物模型，直接闡述高胰島素對主動脈內(nèi)膜損傷作用并探討其可能機制。
　　方法:采用持續(xù)皮下注射胰島素方法建立高胰島素血癥SD大鼠模型(Hins)(N=7)，并設立對照組SD大鼠(Con)(N=7)。大鼠處死前測體重，尾靜脈采血測空腹血糖(

8、FBG);心臟穿刺法留取空腹血標本，全自動生化分析儀測總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，高敏C反應蛋白(hs-CRP); ELISA法血漿空腹胰島素(Fins)，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);比色法測血漿NO、高效液相色譜(HPLC)法測血漿ADMA濃度。大鼠處死后立刻開胸，分離升主動脈組織，快速存入液氮，4％甲醛固定。提取大鼠主動脈組織蛋白，Western-

9、Blotting法檢測主動脈SREBP-1、SREBP-2，DDAH-1、DDAH-2蛋白表達;Trizol法提取主動脈組織mRNA，RT-PCR法檢測上述基因表達。
　　結(jié)果:1.Hins組大鼠血漿空腹血糖、胰島素、HOMA-IR與甘油三酯(TG)均顯著高于Con組大鼠(P＜0.05)，高胰島素血癥SD大鼠模型成功。2.Hins組大鼠體重顯著性高于Con組大鼠(P＜0.05)。3.兩組大鼠膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LD

10、L-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)無統(tǒng)計學差異。Hins組大鼠ADMA、hs-CRP顯著高于Con組(P＜0.05)，NO顯著低于Con組(P＜0.05)。4.與Con組大鼠相比，Hins組大鼠主動脈組織SREBP-1、SREBP-2蛋白與基因表達顯著升高(P＜0.05)，DDAH-1、DDAH-2蛋白與基因表達顯著下降(P＜0.05)。5.主動脈形態(tài)學改變:Con組大鼠主動脈內(nèi)膜光滑，細胞排列整齊，層次清晰;Hins組大鼠主動

11、脈內(nèi)膜不規(guī)整，細胞排列紊亂。
　　結(jié)論:1.持續(xù)皮下注射胰島素可制作高胰島素血癥SD大鼠模型，為研究高胰島素對機體的影響提供了可行的動物模型;2.高胰島素血癥SD大鼠血漿ADMA濃度升高、NO濃度降低，提示內(nèi)皮功能受損;3.高胰島素血癥SD大鼠主動脈內(nèi)膜形態(tài)發(fā)生改變，為內(nèi)皮受損表現(xiàn);4.高胰島素血癥SD大鼠主動脈組織SREBP-1、SREBP-2基因與蛋白表達增加，DDAH1、DDAH2基因與蛋白表達降低，可能是高胰島素損傷血管內(nèi)

12、皮新機制。
　　第三章高胰島素對臍靜脈內(nèi)皮細胞DDAH1、DDAH2基因和蛋白表達的影響及其機制研究。
　　目的:高胰島素血癥是心血管事件的重要危險因素，我們前期臨床試驗和動物實驗發(fā)現(xiàn):高胰島素抑制DDAH基因與蛋白表達，促進SREBPs基因與蛋白表達。在此基礎上，本章通過細胞實驗，進一步證實高胰島素對內(nèi)皮細胞DDAH1和DDAH2基因與蛋白表達的影響，并利用siRNA轉(zhuǎn)染技術，抑制SREBP-1和SREBP-2基因表達，以

13、探討高胰島索引起內(nèi)皮細胞損傷的具體機制。
　　方法:1、采用不同濃度的胰島素處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cells，HUVEC)，并分為24小時和48小時處理組，測定葡萄糖攝取率，分析不同濃度胰島素、作用不同時間對細胞攝取葡萄糖能力的影響。2、順利完成siRNA轉(zhuǎn)染預實驗后，將HUVEC分為兩大組，分別用于siRNA轉(zhuǎn)染 SREBP-1和SREBP-2實驗，siRNA轉(zhuǎn)染S

14、REBP-1實驗具體分組如下:(1)A1組:正常培養(yǎng)HUVEC48h;(2) B1組:培基中6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)HUVEC細胞48h;(3) C1組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-NC，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h;(4)D1組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP1，正常培養(yǎng)48h;(5) E1組: HUVEC轉(zhuǎn)’染siRNA-SREBP1，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h。siRNA轉(zhuǎn)染SREBP-2實驗具體

15、分組如下:(6) A2組:正常培養(yǎng)HUVEC48h;(7) B2組:培基中6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)HUVEC細胞48h;(8) C2組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-NC，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h;(9) D2組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP2，正常培養(yǎng)48h;(10)E2組:HUVEC轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP2，6×10-8mol/L胰島素培養(yǎng)48h。細胞經(jīng)上述處理完畢后，提取各組mRNA和蛋白，Real-

16、Time PCR檢測SREBP-1、SREBP-2、DDAH1和DDAH2的基因表達，Western-Blot檢測上述蛋白表達。
　　結(jié)果:1.低濃度胰島素促HUVEC攝取葡萄糖，隨著胰島素濃度的升高，HUVEC的葡萄糖攝取率逐漸增高，當胰島素濃度超過一定范圍后，隨著胰島素濃度的升高，HUVEC的葡萄糖攝取率反而隨之下降。2.6×10-8mol/L胰島素孵育HUVEC48h顯著誘導HUVEC中的SREBP-1和SREBP-2的基因

17、和蛋白表達(P＜0.05)，同時顯著誘導轉(zhuǎn)染si-RNA-NC組的SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表達(P＜0.05)。3.6×10-8mol/L胰島素孵育HUVEC48h顯著抑制HUVEC的DDAH1、2基因與蛋白表達(P＜0.05)，同時顯著抑制轉(zhuǎn)染si-RNA-NC組的SREBP-1、2基因與蛋白的表達(P＜0.05)。4.單純轉(zhuǎn)染siRNA-SREBP-1和siRNA-SREBP-2組不能上調(diào)DDAH1、2基因和蛋白表

18、達，但轉(zhuǎn)染了siRNA-SREBP-1、2的高胰島素處理組DDAH1、2基因與蛋白的下調(diào)作用被顯著削弱(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.高濃度胰島素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞攝取葡萄糖，可能與損傷有關;2.高濃度胰島素促進入臍靜脈內(nèi)皮細胞SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表達，抑制其DDAH1和DDAH2的基因和蛋白表達;3.siRNA沉默人臍靜脈內(nèi)皮細胞SREBP-1和SREBP-2基因，削弱了高胰島素對DDAH1和DDAH2