硫化氫預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性心肌梗死(AMI)及其引起的心力衰竭是目前世界范圍內(nèi)危害人類健康的重要疾病，近20余年來以干細(xì)胞治療為代表的心肌再生醫(yī)學(xué)成為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的熱點(diǎn)，干細(xì)胞療法已成為治療AMI最有前途的方法之一，但多項(xiàng)臨床研究均提示骨髓干細(xì)胞治療對(duì)AMI后心功能的改善非常有限。移植后干細(xì)胞存活率低下是制約干細(xì)胞治療效果的重要因素。有研究表明移植4天后局部干細(xì)胞的存活率僅為0.44％，隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長，干細(xì)胞在心肌局部的存活率繼續(xù)顯著降低?；谶@

2、些研究發(fā)現(xiàn)我們有理由相信提高干細(xì)胞的存活率無疑可顯著提高干細(xì)胞的治療效果。
　　 硫化氫是繼一氧化氮、一氧化碳后發(fā)現(xiàn)的存在于人體內(nèi)的第三類氣體信號(hào)分子。其參與體內(nèi)多個(gè)生理過程包括細(xì)胞保護(hù)、血管新生、血管擴(kuò)張及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。雖然其細(xì)胞保護(hù)作用在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但目前尚無硫化氫與干細(xì)胞相互作用的相關(guān)研究。
　　 本文著眼于提高干細(xì)胞存活率這一影響干細(xì)胞治療效果的重要因素，從硫化氫對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可能作用入手，分為體

3、內(nèi)、體外兩個(gè)主要部分探討了硫化氫對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要分為以下三個(gè)部分：
　　 第一部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化
　　 目的：分離培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，為此后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長過程。以流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原，并檢測體外標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)條件下該類

4、細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　 結(jié)果：原代細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形，貼壁集落生長。體外傳代培養(yǎng)2代后細(xì)胞呈較均一性成纖維樣，均勻生長。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原，結(jié)果表明培養(yǎng)細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD90，而少表達(dá)造血干細(xì)胞抗原CD34。標(biāo)準(zhǔn)成脂誘導(dǎo)條件下，油紅染色證實(shí)其可向脂肪細(xì)胞分化。
　　 結(jié)論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法可獲取較高純度的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，滿足體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)要求。
　　 第二部分、硫化氫對(duì)缺氧誘導(dǎo)大鼠骨髓間充

5、質(zhì)干細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　 目的：證實(shí)硫化氫預(yù)處理對(duì)缺氧誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的潛在保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：建立體外缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型；給予或不給予細(xì)胞硫化氫預(yù)處理，缺氧誘導(dǎo)后流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡，臺(tái)盼藍(lán)染色及CCK-8法檢測細(xì)胞活力；熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；Western blot檢測pAkt、pErk1/2、peNOS、pFo

6、x01、pGSK-3β、Fox01、Akt、Erk1/2、Pim-1、Bcl-2及Bax的表達(dá)變化。劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)硫化氫預(yù)處理對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移作用的影響。ELISA法檢測培養(yǎng)液上清VEGF水平評(píng)價(jià)硫化氫預(yù)處理對(duì)干細(xì)胞旁分泌的影響。
　　 結(jié)果：無糖、無血清培養(yǎng)條件下缺氧6小時(shí)可成功誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡；10～300μ mol/L硫化氫預(yù)處理30分鐘可濃度依賴性減少缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；此后本實(shí)驗(yàn)采用200μ mol/L硫化氫作為干

7、預(yù)濃度；結(jié)果提示200μ mol/L硫化氫預(yù)處理可明顯減少缺氧條件下細(xì)胞凋亡，流式檢測細(xì)胞凋亡率由25.45％降至14.09％(P<0.05)，200μ mol/L硫化氫預(yù)處理可增強(qiáng)細(xì)胞活力(臺(tái)盼藍(lán)染色：67％vs46％，P<0.05；CCK-8:52％vs38％，P<0.05)，此外硫化氫預(yù)處理還可明顯減少缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高；Western blot表明硫化氫預(yù)處理可明顯提高間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)Akt，Erk1/2及GSK-3β

8、的磷酸化水平；并且在缺氧培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)Pinr-1、Bcl-2的蛋白表達(dá)，抑制Bax的蛋白表達(dá)，提示硫化氫可能通過PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-3β途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。硫化氫預(yù)處理對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移無明顯影響，而且我們也未觀察到其對(duì)于細(xì)胞旁分泌作用的影響。
　　 結(jié)論：硫化氫預(yù)處理可明顯減輕缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞活力。這種保護(hù)作用可能是通過激活PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-

9、3β途徑并減少細(xì)胞內(nèi)活性氧水平實(shí)現(xiàn)的。
　　 第三部分、硫化氫預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠急性心肌梗死的在體研究
　　 目的：體外實(shí)驗(yàn)中硫化氫預(yù)處理可明顯減少缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，本部分實(shí)驗(yàn)主要研究硫化氫預(yù)處理是否可增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死的療效。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增雄性SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。采用結(jié)扎前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，造模成功后即刻用微量注射器在左室前壁沿梗死邊

10、緣多點(diǎn)注射1×106個(gè)細(xì)胞/100ul或等量PBS。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要分為兩個(gè)部分：(1)雌雄不匹配心肌梗死模型在體評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后細(xì)胞存活率：選擇雌性SD大鼠造模，移植細(xì)胞來源于雄性大鼠。造模成功后隨機(jī)分為兩組并進(jìn)行干細(xì)胞移植：MSCs組心肌內(nèi)注射1×106個(gè)未經(jīng)硫化氫預(yù)處理的干細(xì)胞，H2S組心肌內(nèi)注射1×106個(gè)硫化氫預(yù)處理的干細(xì)胞。4天后取材提取組織DNA，Real-time PCR檢測sry基因評(píng)價(jià)干細(xì)胞存活率。(2)雌雄匹配模型評(píng)價(jià)細(xì)

11、胞移植后心臟功能及左室重構(gòu)：干細(xì)胞來源及造模動(dòng)物均為雄性大鼠。造模成功后隨機(jī)分為三組并進(jìn)行干細(xì)胞移植：PBS組心肌內(nèi)注射100μ1 PBS；MSCs組心肌內(nèi)注射1×106個(gè)未經(jīng)硫化氫預(yù)處理的干細(xì)胞，H2S組心肌內(nèi)注射1×106個(gè)硫化氫預(yù)處理的干細(xì)胞。4周后心超評(píng)價(jià)左室收縮功能；Tunel法評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡率；Masson染色評(píng)價(jià)梗死面積及心肌內(nèi)纖維沉積情況；CD31免疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)新生血管情況。
　　 結(jié)果：4周后心超結(jié)果提

12、示H2S組及MSC組心功能明顯優(yōu)于PBS組(LVEF：45.35±2.25％vs36.92±0.79％vs30.29±1.80％)，且H2S組好于MSC組。雖然三組間心肌細(xì)胞凋亡無明顯差異。但與PBS組相比，兩組干細(xì)胞治療均可減少心梗后梗死面積(30.30±3.37％vs39.78±3.14％vs49.12±2.25％)及心肌內(nèi)纖維沉積，且H2S組的改善作用更為明顯。免疫組化結(jié)果提示與PBS及MSCs組相比，硫化氫預(yù)處理后的干細(xì)胞治療組