人膽囊組織比較蛋白質(zhì)組學研究及相關(guān)蛋白功能驗證.pdf

1、本研究以比較蛋白質(zhì)組學研究思想為理論指導，選擇膽固醇結(jié)石患者和正常人膽囊壁組織蛋白質(zhì)為研究對象，應用2-DE及MALDI-TOF/TOF MS作為研究手段，預期可以發(fā)現(xiàn)一些新的在膽固醇結(jié)石形成中占重要作用蛋白質(zhì)，通過相應的鑒定和生物學功能驗證，為我們進一步深入揭示人類膽固醇結(jié)石形成的分子遺傳機制及篩選特異性診斷標志物提供一定的理論基礎與實驗依據(jù)。
　　第一部分人膽囊全層組織蛋白質(zhì)表達譜的建立
　　目的建立、優(yōu)化膽固醇結(jié)石病人

2、與正常人膽囊組織的蛋白質(zhì)表達譜，用于膽囊組織的比較蛋白質(zhì)組學研究，為探討膽石成因提供實驗依據(jù)。方法提取膽固醇結(jié)石患者和正常人膽囊壁組織總蛋白，構(gòu)建相應的雙向電泳蛋白質(zhì)表達譜，應用ImageMaster圖像分析軟件獲得差異蛋白點信息。結(jié)果膽固醇結(jié)石患者與正常人膽囊壁總蛋白濃度分別為7.45 mg/mL和4.36 mg/ml(P<0.01)。兩組樣本均獲得分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜，膽固醇結(jié)石病人組與正常組內(nèi)蛋白質(zhì)平均匹配點數(shù)分別為6

3、32±61和606±64，各匹配率分別為73.46％和71.49％。組間蛋白質(zhì)平均匹配點為474，匹配率為70.64％。膽固醇結(jié)石病人的27個蛋白點表達上調(diào)，8個點表達下調(diào)，與正常人間蛋白表達差異明顯(P<0.05)。結(jié)論初步建立了膽固醇結(jié)石病人與正常人膽囊組織的差異蛋白質(zhì)表達譜，分析兩者間差異蛋白點，為膽石成因研究提供實驗基礎。
　　第二部分人膽囊漿膜下組織比較蛋白質(zhì)組學研究
　　目的建立、優(yōu)化人膽囊壁漿膜層組織的蛋白質(zhì)表

4、達譜和人膽囊壁漿膜下層組織的蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)平臺，比較分析膽固醇結(jié)石患者與正常人膽囊壁漿膜下組織蛋白表達譜的差異，通過質(zhì)譜技術(shù)篩選漿膜下層組織差異表達蛋白。方法提取膽固醇結(jié)石患者和正常人膽囊壁漿膜層和漿膜下組織總蛋白，構(gòu)建相應的雙向電泳蛋白質(zhì)表達譜，應用ImageMaster圖像分析軟件獲得差異蛋白點信息，質(zhì)譜鑒定漿膜下層差異表達蛋白質(zhì)。結(jié)果膽固醇結(jié)石病人與正常人的膽囊漿膜層和漿膜下層組織差異蛋白質(zhì)表達譜均獲得分辨率高、重復性好的雙向

5、電泳圖譜，漿膜下層組織差異表達譜結(jié)果顯示19個蛋白點在兩者之間差異較大，質(zhì)譜成功鑒定11個蛋白，1個重復。其中Tropomyosin4，Transgelin，Transthyretin，Cyanomet Rhb1.1，Haptoglobin-related protein precursor在結(jié)石組中表達上調(diào)，Myosin，Peroxiredoxin3，Hypothetical protein，T cell receptor alpha

6、 chain在結(jié)石組中表達下調(diào)。結(jié)論初步建立了膽固醇結(jié)石病人與正常人膽囊漿膜層與漿膜下層組織的差異蛋白質(zhì)表達譜，對漿膜下層組織分析并成功鑒定差異蛋白點，為膽固醇結(jié)石形成的關(guān)鍵調(diào)控蛋白質(zhì)研究提供實驗依據(jù)。
　　第三部分差異表達蛋白質(zhì)的再驗證
　　目的對漿膜下層組織比較蛋白質(zhì)組學篩選出的差異表達蛋白質(zhì)進行再驗證，以保證初篩結(jié)果的可信度及進一步功能學研究的確定性。方法通過Western Blotting和RT-PCR技術(shù)驗證TTR

7、、SM22-alpha、TPM4、Prx3這4種差異表達蛋白在膽固醇結(jié)石患者和正常人的膽囊組織中的表達情況。結(jié)果Western Blotting證實TTR、SM22-alpha、TPM4在膽固醇結(jié)石患者膽囊壁中較正常對照組上調(diào)，RT-PCR證實SM22-alpha在結(jié)石組中表達上調(diào)，Prx3則表達下調(diào)。結(jié)論 Western Blotting和 RT-PCR對差異表達蛋白質(zhì)的再驗證結(jié)果表明我們使用的2-DE、ImageMaster2D P

8、latinum5.0 software分析、質(zhì)譜鑒定等比較蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)平臺的準確性、穩(wěn)定性和結(jié)果可靠性。
　　第四部分運甲狀腺素蛋白促成核功能的初步研究
　　目的觀測TTR在體外模擬膽汁體系中的成核活性。方法構(gòu)建Small和綜合模擬膽汁體系，運用Holan觀測成核時間法，探討TTR的促成核效應。結(jié)果 TTR組的成核時間在Small模擬膽汁體系中平均為(14.5±1.29)d，綜合模擬膽汁體系中平均為(13.5±0.58

9、)d，TTR可以促進膽固醇結(jié)石成核、結(jié)晶。結(jié)論在體外模擬膽汁體系中TTR具有促成核活性，為進一步研究其在膽固醇結(jié)石發(fā)病機制中的作用提供一定的實驗依據(jù)。
　　綜上所述，本課題通過比較蛋白質(zhì)組學技術(shù)建立了膽固醇結(jié)石組和正常對照組的膽囊組織、漿膜層組織、漿膜下層組織的蛋白質(zhì)表達譜，對漿膜下層組織篩選、成功鑒定出差異蛋白質(zhì)點11個，重復1個，運用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)和RT-PCR方法進行了TTR、SM22-alpha、TPM4、Prx3四種