三聚氰胺及三聚氰酸誘導大鼠腎臟損害及結石的研究.pdf

1、研究背景：
　　 研究顯示2007年3月美國大量寵物中毒發(fā)生急性腎衰事件,是由于寵物食物中混有8.4％的三聚氰胺和5.3％三聚氰酸；而導致我國2008年9月因服用“問題奶粉”出現(xiàn)近30萬嬰幼兒發(fā)生泌尿系結石及泌尿系異常的因為則是“問題奶粉”中含有大量濃度不等的三聚氰胺。研究二者誘導腎臟損害及泌尿系結石的病理過程和發(fā)病機制,尋找預防和治療此類腎臟損害和結石的有效方法,是目前國內(nèi)外專家們急需積極研究的熱點方向。
　　 既往研

2、究顯示三聚氰胺和三聚氰酸在哺乳動物體內(nèi)屬于惰性代謝,即在體內(nèi)不會被轉(zhuǎn)化,亦不會蓄積體內(nèi),均以原型從尿液中排出。其中三聚氰胺在體內(nèi)的半衰期約為2.7h,三聚氰酸為2.5h,因此泌尿系統(tǒng)容易成為三聚氰胺與三聚氰酸損害的靶器官。國外的動物實驗顯示長期單獨大劑量攝入三聚氰胺或三聚氰酸導致膀胱癌、膀胱結石、腎小管上皮增生、擴張及腎纖維化等。而2008年Dobson等人的研究證實了三聚氰胺和三聚氰酸同時混合攝入導致大鼠急性腎衰竭而死亡,且病理解剖提

3、示腎小管堵塞了大量結晶,同時發(fā)現(xiàn)其他器官未受明顯影響,并通過檢測發(fā)現(xiàn)腎組織中的結晶是三聚氰胺和三聚氰酸1:1結合的晶體。另外Dobson等人的研究還證明了單獨攝入三聚氰胺或三聚氰酸并未對大鼠腎臟造成損害,而且三聚氰胺或三聚氰酸在體內(nèi)所能達到的濃度限制內(nèi)是不會對腎臟細胞造成毒性作用的。目前同系物三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺尚無致腎損害及結石的數(shù)據(jù)。
　　 由于三聚氰胺含氮量較高,因而被非法添加到寵物飼料、牛奶以及其它蛋自制品中以

4、虛假提高蛋白含量。然而純度不高的三聚氰胺往往混雜有三聚氰酸,或者在食品加工過程中三聚氰胺可以少量轉(zhuǎn)化成三聚氰酸。我國“問題奶粉”事件后質(zhì)檢總局隨后在全國開展了嬰幼兒奶粉專項檢查,其中在某品牌奶粉中檢測出三聚氰胺含量高達2563mg/kg,但未報道檢測出三聚氰酸。此外,北京大學一附院的研究發(fā)現(xiàn)暴露在三聚氰胺的患兒泌尿系結石發(fā)病率比正常嬰幼兒高出7倍,北京兒童醫(yī)院分析出“問題奶粉”患兒結石成分為“三聚氰胺和尿酸”,所以目前國內(nèi)一直認為是三聚

5、氰胺與尿酸造成嬰幼兒發(fā)生腎結石。
　　 急性腎衰(ARF)的發(fā)病機制主要分為腎前性、腎性和腎后性,而三聚氰胺和三聚氰酸被證明無直接腎毒性,其對腎臟損害的主要因為可能是腎后性梗阻引起的ARF。泌尿系結石的種類和發(fā)病機制十分復雜,而目前研究證明與三聚氰胺相關的結石很可能與尿酸一類結石相關,這可能與三嗪類化合物影響體內(nèi)代謝,以及其分子結構更易誘導尿酸的趨向附生而形成結石有關,故需要研究三聚氰胺和三聚氰酸對尿酸排泄量、尿PH值、尿量等誘

6、發(fā)尿酸結石的關鍵因素的影響。
　　 “問題奶粉”對泌尿系損害機制尚未完全明確,基于受檢測的問題奶粉中含三聚氰胺最高劑量為2563mg/kg,再根據(jù)嬰兒最小平均體重(6kg)、平均每日攝入奶粉量(150g)及大鼠與人體藥理換算公式(約6.3:1),我們計算出復制大鼠模型每天應攝入最大三聚氰胺劑量約為403.7 mg/kg。同時參考國外的動物實驗劑量,設計了本實驗給藥劑量進行研究。本實驗采用三聚氰胺和三聚氰酸單獨及聯(lián)合灌胃給藥方法,

7、建立大鼠腎臟損害模型進行研究,旨在探明三聚氰胺及其同系物三聚氰酸對腎臟損害和誘發(fā)結石的機制,為進一步尋求防治方法提供實驗依據(jù)。
　　 研究目的:
　　 1、探討單獨的三聚氰胺或三聚氰酸對大鼠腎臟損害及誘發(fā)泌尿系結石的機制,并分析結石晶體成分。
　　 2、探討三聚氰胺和三聚氰酸的聯(lián)合效應損害大鼠腎臟及誘發(fā)泌尿系結石的機制,并分析結石晶體成分。
　　 3、通過大鼠的實驗研究來探討“問題奶粉”致嬰幼兒泌尿系結石

8、的可能機制。
　　 研究方法:
　　 1、制作模型和分組
　　 將60只SD大鼠隨機分成A組(空白對照組)、B組(三聚氰胺400mg·kg-1·d-1)、C組(三聚氰酸400mg·kg-1·d-1)、D組(三聚氰胺400mg·kg-1·d-1+三聚氰酸400mg·kg-1·d-1)、E組(三聚氰胺30mg·kg-1·d-1+三聚氰酸30mg·kg-1·d-1),每組12只,通過灌胃給藥。
　　 2、指標的

9、收集和檢測
　　 用代謝籠收集前3天24小時尿液,進行24小時尿量、PH值和24小時尿酸排泄量測量及尿沉渣涂片檢查；分別于第4天、第31天灌胃前每組采集6只大鼠的血液標本檢測血肌酐、尿素氮、尿酸；取雙側(cè)腎臟用外科顯微鏡觀察后,制作快速冰凍切片及石蠟切片(HE染色)觀察腎臟病理改變及晶體形成。腎臟冰凍組織切成5μm薄片后,用紅外顯微光譜儀檢測晶體成分。
　　 3、采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以(x)±s

10、表示。尿液數(shù)據(jù)和血液數(shù)據(jù)分別采用重復測量方差分析和析因方差分析。當P<0.05時,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、尿液和血液生化結果
　　 與A組比較,B組和C組大鼠的24h尿尿量、24h尿酸排泄量均明顯增多,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而D、E組尿量明顯減少、PH值降低、24h尿酸排泄量明顯減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中D組變化比E組更為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

11、。在相應時間點各組與A組比較,B組和C組的血肌酐、血尿酸及血尿素氮均升高,但在第4天時候僅血尿素氮差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而第31天血尿素氮及血尿酸差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； D組在第4天的時候各項指標均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E組第4天血肌酐及血尿素氮明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),第31天則各項指標明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中D組比E組變化更為明顯,差異有統(tǒng)計

12、學意義(P<0.05),同時E組各項指標第31天比第4天顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(見表2)
　　 2、尿沉渣涂片
　　 從尿沉渣涂片中可見:A組尿液無明顯晶體；B組可見疑似三聚氰胺原型的晶體；C組無明顯晶體,但有少許細沙樣小顆粒沉淀物；D組及E組均可見淡黃色圓形特異性晶體。
　　 3、腎臟病理改變
　　 大體標本:A組大鼠腎臟包膜光滑暗紅色,腎臟解剖觀察無明顯病理改變。B、C組大鼠腎臟

13、皮髓結構清晰,腎盞及腎盂良好,未見結石晶體沉積。D組大鼠腎臟明顯腫大,外觀呈灰黃色,包膜有許多散在黃色斑點,腎臟皮質(zhì)變薄,腎盞、腎盂結構破壞,腎內(nèi)布滿淡黃色結石晶體。E組第4天皮髓結構尚清晰,可見不少淡黃色結石晶體沉積；第31天E組大鼠腎臟剖面呈紅褐色,皮髓變模糊,大量淡黃色顆粒沉積。各組大鼠膀胱均未見觀察到結石。
　　 腎組織切片:A組大鼠未見明顯病理改變。B組及C組腎組織石蠟切片與冰凍切片在第4天的時候均未見結晶及明顯病理改

14、變；第31天亦未見晶體,僅見少量腎小管輕度擴張、上皮細胞腫脹和少量管型形成等。D組與E組腎組織石蠟切片與冰凍切片均可見淡黃色、呈放射狀的同心圓形晶體,主要集聚于腎小管,也見于集合管、間質(zhì)及被膜下,偶見于腎小球囊中,大多晶體以不規(guī)則碎片出現(xiàn)于腎小管中。此外,腎小管濁腫、上皮受損,并有各種管型形成,大量炎性細胞在腎小球囊腔、腎小管及間質(zhì)中:E組第31天還可看到許多纖維細胞充滿間質(zhì)。此外第4天D組切片單倍視野下結石晶體數(shù)量和體積,以及組織病理

15、變化都大于E組；而第31天E組結石晶體數(shù)量、體積以及組織病理變化都比其在第4天觀察到的要大。
　　 4、腎組織晶體成分分析結果
　　 對混合組大鼠腎臟出現(xiàn)的各種形態(tài)結石晶體進行紅外顯微光譜分析,得到基本一致的紅外光譜圖；根據(jù)專業(yè)分析,及查閱相關文獻可知混合藥物組大鼠在腎臟生成的晶體即為三聚氰胺氰尿酸鹽晶體。
　　 結論:
　　 1、三聚氰胺和三聚氰酸同時混合進入體內(nèi),會在腎臟形成一種不溶于水的三聚氰胺氰尿

16、酸鹽晶體,此晶體能堵塞腎小管造成腎臟損害甚至急性腎衰竭,并可以作為結石核心與尿酸等成分一起誘發(fā)泌尿系結石；
　　 2、三聚氰胺與其同系物三聚氰酸對腎臟的損害較輕,機制相似；單獨攝入三聚氰胺或三聚氰酸,大鼠腎臟無結石晶體形成,但長期攝入會對腎功能造成損害,其因為為長期的滲透性利尿?qū)е挛锢硇該p傷腎組織；
　　 3、三聚氰胺與三聚氰酸的聯(lián)合效應比它們的單獨效應對腎臟的損害作用更大,更容易誘發(fā)泌尿系尿酸結石；其聯(lián)合效應與聯(lián)合藥物