蛇床子素在大鼠原代肝細(xì)胞中代謝的研究.pdf

1、目的: 采用大鼠原代肝細(xì)胞體外溫孵液對(duì)蛇床子素(Ost)在肝細(xì)胞中代謝轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行研究。分析Ost在大鼠肝細(xì)胞中的代謝途徑和機(jī)制，探討Ost在CYP450酶系相關(guān)亞型中的代謝，及CYP450酶誘導(dǎo)劑和抑制劑對(duì)Ost代謝的影響。為更深入地研究Ost的藥動(dòng)學(xué)及其臨床上合理用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: ①建立大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法和大鼠肝細(xì)胞體外溫孵體系。通過臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)、光學(xué)顯微鏡、透射電鏡檢查、HE染色對(duì)肝

2、細(xì)胞的產(chǎn)率，活力，細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。 ②通過MTT方法測(cè)定不同濃度Ost對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞活力的影響。 ③建立Ost的HPLC-UV檢測(cè)方法。 ④通過溫孵時(shí)間、肝細(xì)胞含量、底物濃度三個(gè)方面來考察Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中的酶促動(dòng)力學(xué)特征。 ⑤研究CYP3A4誘導(dǎo)劑利福平(Rif)、CYP2D6抑制劑育亨賓(Yoh)、CYP2C9抑制劑磺胺嘧啶(Sul)、CYP2C8抑制劑槲皮素(Que

3、)對(duì)Ost在大鼠肝細(xì)胞溫孵液中代謝的影響。 ⑥選擇CYP3A4特異性抑制劑醋竹桃霉素(Tro)，觀察其對(duì)Ost體外代謝的抑制效應(yīng)。 結(jié)果: ①建立了成熟的大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法和大鼠原代肝細(xì)胞溫孵體系，肝細(xì)胞產(chǎn)率為1-2 × 108/肝，肝細(xì)胞活力和純度均在90％以上。 ②Ost的濃度在0-20μM范圍內(nèi)對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞活力與空白對(duì)照組相比，未見顯著影響，肝細(xì)胞活力＞80％。 ③Ost的HPLC

4、檢測(cè)方法為流動(dòng)相：甲醇：雙蒸水=80:20(V/V)；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：322nm;靈敏度：0.004 Aufs。 ④Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中呈現(xiàn)明顯的酶促動(dòng)力學(xué)特征：當(dāng)Ost的濃度在0-10μM，Ost的代謝呈濃度依賴性，代謝消除量隨底物濃度增加呈線性增加；當(dāng)濃度超過10μM，Ost代謝出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，代謝消除量不再隨著底物濃度的增加而增加。Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中經(jīng)37℃空氣浴振蕩器振蕩孵育15～

5、120min，呈時(shí)間依賴性線性消除。溫孵液中肝細(xì)胞的濃度在5 × 105～1×107/ml范圍內(nèi)，Ost的代謝量隨肝細(xì)胞濃度增加而增加，呈線性消除。⑤CYP2D6抑制劑Yoh、CYP2C9抑制劑Sul、CYP2C8抑制劑Que對(duì)Ost的代謝消除率的影響與對(duì)照組相比無明顯區(qū)別(P＞0.05)，在與CYP3A4誘導(dǎo)劑Rif共孵育的肝細(xì)胞溫孵液中Ost的代謝消除率與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。 ⑥CYP3A4抑制劑Tro

6、呈劑量依賴性抑制Ost在大鼠肝細(xì)胞中的代謝。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠原代肝細(xì)胞分離方法和肝細(xì)胞體外溫孵液穩(wěn)定、可靠，能滿足本實(shí)驗(yàn)藥物代謝的要求。Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液代謝實(shí)驗(yàn)研究提示Ost的代謝具有酶促動(dòng)力學(xué)代謝特征。CYP2D6抑制劑Yoh、CYP2C9抑制劑Sul、CYP2C8抑制劑Que不抑制Ost在大鼠肝細(xì)胞體外溫孵液中的代謝。CYP3A4誘導(dǎo)劑Rif則明顯誘導(dǎo)Ost的代謝；CYP3A4抑制劑Tro呈劑量