間皮素在卵巢上皮性癌診斷、病情監(jiān)測中的價值評價及在順鉑耐藥中的作用和機制研究.pdf

1、卵巢上皮性癌(Epithelial ovarian cance,EOC,簡稱卵巢癌)是女性生殖系統(tǒng)常見的一種惡性腫瘤,致死率在婦科腫瘤中占首位,五年生存率僅為30％。這是因為卵巢癌早期診斷困難,70％的患者確診時已是晚期。而且晚期患者在經(jīng)過腫瘤細胞減滅術聯(lián)合以鉑類為基礎的化療后,雖然得到緩解,但是60％的患者最終會復發(fā),其中主要的原因是出現(xiàn)順鉑耐藥。因此臨床亟需新的卵巢癌腫瘤標志物和解決順鉑耐藥的新的途徑。
　　 間皮素(Mes

2、othelin MSLN)是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞表面抗原,在正常組織中通常僅表達在體腔表面的間皮細胞,在惡性間皮瘤、卵巢癌和胰腺癌等惡性腫瘤中過表達。間皮素基因編碼的間皮素蛋白是一種以糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上的糖蛋白,全長69KDa,可被蛋白水解酶分裂釋放出一個33KDa的可溶性蛋白,另外遺留下膜結合的蛋白(40KDa)作為細胞粘附分子。可溶性間皮素相關蛋白(Soluble mesothelin relatedprotein SMR

3、P)是42-45KDa的蛋白質,可能為膜結合間皮素的蛋白水解產(chǎn)物。由于SMRP可以釋放入血且分子量明顯低于卵巢癌標記物CA125,所以理論上靈敏度要高于CA125,從而有希望成為卵巢癌早期診斷的標記物。
　　 目前的研究證實間皮素可促進腫瘤細胞的增殖,增強其粘附、遷移的能力,但是還有很多生物學功能尚不可知。有研究發(fā)現(xiàn)間皮素在卵巢癌順鉑耐藥組織中明顯高表達,且與不良預后相關,提示間皮素的表達與化療耐藥有關。由此我們推斷間皮素可能在

4、卵巢癌順鉑耐藥過程中發(fā)揮著重要作用,有望成為順鉑耐藥治療的新的靶點。
　　 本課題首先將間皮素與卵巢癌常用標志物CA125和新發(fā)現(xiàn)的重要卵巢癌標志物HE4做同期比較,并分別將三者聯(lián)合檢測,對間皮素的臨床價值作出客觀評價。然后從基因水平和蛋白水平分別檢測卵巢癌耐藥細胞株間皮素的表達。接著以SKOV3/cDDP細胞為例,應用RNAi技術沉默耐藥細胞株表面間皮素的表達,進而通過MTT藥物敏感試驗、集落形成試驗和流式細胞術來檢測間皮素沉

5、默后耐藥細胞對順鉑敏感性的變化,并從耐藥蛋白表達的改變,細胞內谷胱甘肽水平等方面探討間皮素在順鉑耐藥方面的可能作用機制。最后我們建立荷人卵巢癌耐藥細胞株裸鼠移植瘤模型,用包裝有間皮素siRNA的慢病毒液聯(lián)合順鉑進行治療,在體內水平進一步驗證間皮素沉默后耐藥卵巢癌組織對順鉑的敏感性,探討間皮素沉默逆轉順鉑耐藥的可能性,從而為卵巢癌的耐藥逆轉研究提供一個新的思路。
　　 第一部分血清SMRP和HE4在卵巢上皮性癌診斷和病情監(jiān)測中的臨

6、床應用
　　 目的:比較血清SMRP和HE4在卵巢良惡性腫瘤和健康志愿者的分布,結合CA125,分析三種標志物單獨和聯(lián)合檢測的診斷效能,探討血清SMRP和HR4在卵巢癌診斷和病情監(jiān)測中的臨床價值。
　　 方法:用酶聯(lián)免疫吸附法測定44例卵巢癌患者,56例良性卵巢上皮性腫瘤患者和40例健康志愿者血清中的SMRP和HE4水平,化學發(fā)光法測定血清CA125,比較三種標志物在不同分組,卵巢癌不同病理類型、不同分化級別、不同分期及

7、良性卵巢上皮性腫瘤不同病理類型的分布,比較三種標志物在卵巢癌術前術后的變化。繪制ROC曲線對三種標志物進行診斷效能評價。分析三種標志物聯(lián)合檢測的診斷價值。
　　 結果:
　　 1卵巢癌的SMRP、HE4和CA125水平均高于良性上皮性腫瘤和健康志愿者(P＜0.05),差別均具有統(tǒng)計學意義。
　　 2漿液性癌的SMRP、HE4和CA125水平均明顯高于粘液性癌,差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3Ⅰ

8、-Ⅱ期的SMRP、HE4和CA125水平均明顯低于Ⅲ-Ⅳ期,差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4 G3的SMRP、HE4和CA125水平明顯高于G2、G1,差別均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5 漿液性囊腺瘤和粘液性囊腺瘤的血清SMRP、HE4和CA125水平分布差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 6 進行了理想腫瘤細胞減滅術的22例患者術后的SMRP、HE4和CA125水平明顯降低,與

9、術前相比差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 7 SMRP的ROC曲線下面積(AUC)為0.861,其95％的可信區(qū)間為(0.778-0.944);HE4的AUC為0.905,其95％的可信區(qū)間為(0.830-0.980);CA125的AUC為0.984,其95％的可信區(qū)間為(0.969-0.999)。
　　 8 根據(jù)ROC曲線,HE4具有最高的特異性(1),SMRP次之(97.92％),CA125最后(89.58

10、％);CA125具有最高的靈敏度(90.91％),HE4次之(86.36％),SMRP最后(77.27％)。
　　 9 Kappa,一致性檢驗:HE4的Kappa值為0.897(P=0.000),SMRP的Kappa值為0.791(P-0.000),CA125的Kappa值為0.776(P=0.000)。10比較三種標志物的聯(lián)合檢測:CA125分別與HE4、SMRP進行平行聯(lián)合檢測靈敏度最高:95.45％,臟4與SMRP平行聯(lián)合

11、檢測特異度最高:97.92％,三者的聯(lián)合并不能提高特異度。在系列聯(lián)合檢測中,三者的任意聯(lián)合特異度均為1。
　　 結論:
　　 1 卵巢癌的SMRP水平明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤和健康志愿者,漿液性癌的SMRP水平明顯高于粘液性癌,隨著分化級別的降低,病理分期的增加,血清SMRP水平升高。
　　 2 卵巢癌的HE4水平明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤和健康志愿者,漿液性卵巢癌的HE4水平明顯高于粘液性癌。隨著分化級別的降

12、低,病理分期的增加,血清HE4水平升高。
　　 3 卵巢癌實施理想腫瘤細胞減滅術后與術前相比,血清SMRP和HE4水平均明顯下降,這兩種指標可作為卵巢癌病情監(jiān)測的指標。
　　 4 血清SMRP,HE4與CA125相比均具有較高的特異度,與臨床診斷一致性方面:HE4明顯優(yōu)于SMRP和CA125,SMRP與CA125基本相當或略優(yōu)于CA125。CA125無論聯(lián)合HE4還是SMRP均可以明顯提高靈敏度或特異度,不需要三種標志物

13、聯(lián)合。SMRP和HE4可在一定程度上補充完善CA125用于卵巢癌診斷和病情監(jiān)測的缺陷。
　　 第二部分 siRNA介導的間皮素沉默在逆轉卵巢癌順鉑耐藥過程中的作用
　　 目的:檢測間皮素(MSLN)在卵巢癌耐藥細胞株上的表達,觀察MSLN沉默后耐藥細胞株對順鉑的敏感性,驗證MSLN沉默是否可逆轉順鉑耐藥,探討MSLN在卵巢癌順鉑耐藥中的可能作用及機制,加深對卵巢癌順鉑耐藥機制的理解。
　　 方法:培養(yǎng)SKOV3和

14、3AO及相應的耐藥細胞:SKOV3/cDDP和3AO/cDDP。應用MTT技術檢測細胞的IC50,計算耐藥指數(shù)(耐藥指數(shù)=IC50耐藥細胞/IC50親本細胞)。應用實時熒光定量PCR技術和Western Blot技術分別從基因水平和蛋白水平檢測四種細胞株上MSLN的表達。應用RNAi技術將耐藥細胞株SKOV3/cDDP中的MSLN沉默,建立穩(wěn)定轉染細胞株,分成三組細胞:①干擾組(SKOV3/cDDP-LV-MSLN-RNAi細胞)②陰性

15、組(SKOV3/cDDP-LV-MSLN-neg細胞);③空白組(SKOV3/cDDP細胞)。三組細胞分別加入順鉑構成實驗組,不加順鉑者構成對照組。用MTT法測定三組細胞在順鉑作用48h時的抑制率,抑制率(％)=(1-OD值實驗組/OD值對照組)×100％,用SPSS13.0軟件計算IC50。用集落形成實驗檢測三組細胞在順鉑作用下的集落抑制率,集落抑制率(％)=(1-克隆實驗組/克隆對照組)×100％。用流式細胞術測定順鉑作用48h時三

16、組細胞的凋亡率,順鉑誘導的凋亡率(％)=凋亡率實驗組-凋亡率對照組。用Westen Blot檢測實驗組三組細胞P-gP,GST-π蛋白的表達。用比色法測定細胞內GSH水平。
　　 結果:
　　 1 SKOV3/cDDP耐藥指數(shù)為4.5,3AO/cDDP耐藥指數(shù)為4.2,屬于低度耐藥。
　　 2 實時熒光定量PCR結果:SKOV3細胞RQ值為1.228±0.259,SKOV3/cDDP細胞RQ值為1.933±0.2

17、52,3AO細胞RQ值為0.972±0.139,3AO/cDDP細胞RQ值為1.595±0.106,差別具有統(tǒng)計學意義(F=26.403,P=0.000),其中與SKOV3/cDDP明顯高于SKOV3,差別具有統(tǒng)計學意義(P=O.000);3AO/cDDP高于3AO,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);SKOV3/cDDP高于3AO/cDDP,差別也具有統(tǒng)計學意義(P=0.008);SKOV3明顯高于3AO,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0

18、.039)。
　　 3 MSLN蛋白表達結果:各細胞株的蛋白含量分別為:3AO為(0.115±0.078),3AO/cDDP為(0.655±0.121),SKOV3組為(0.309±0.130),SKOV3/cDDP組為(0.902±0.137)。四種細胞株MSLN蛋白表達差別具有統(tǒng)計學意義(F=61.511,P=0.000),其中SKOV3/cDDP明顯高于SKOV3,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);3AO/cDDP明顯

19、高于3AO,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000);SKOV3/cDDP高于3AO/cDDP,差別有統(tǒng)計學意義(P=0.000);SKOV3明顯高于3AO,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 4 慢病毒轉染SKOV3/cDDP細胞轉染效率為80-90％,干擾效率為95.72％。
　　 5 實驗組三組細胞暴露于順鉑48h后,各組細胞抑制率均隨順鉑濃度的增加而升高,其中干擾組增加最顯著。空白組的IC50為(5.365

20、±0.259)mg/L,陰性組的IC50為(5.248±0.422)mg/L,干擾組的IC50為(2.661±0.158)mg/L,三者相比差別具有統(tǒng)計學意義(F=77.851,P=0.000),其中干擾組的IC50明顯低于其他兩組(P=0.000),其他兩組IC50相比差別無統(tǒng)計學意義(P=0.651)。干擾組細胞對順鉑的敏感性提高了約2.01倍。
　　 6 空白組、陰性組和干擾組的集落抑制率分別為(44.683±3.767)

21、％,(45.488±3.303)％,(64.56±2.904)％,三組相比差別具有統(tǒng)計學意義(F=67.935,P=0.000),干擾組的集落抑制率明顯高于其他兩組,差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),陰性組和空白組的集落抑制率無統(tǒng)計學差異(P=0.683)。
　　 7 流式細胞術凋亡率:空白組、陰性組和干擾組順鉑誘導的凋亡率分別為(19.667±5.417)％,(18.733±7.057)％,(39.867±5.463)％,三

22、組相比差別具有統(tǒng)計學意義(F=11.774,P=0.008)。干擾組順鉑誘導的凋亡率明顯高于其他兩組,差別無統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其他兩組相比差別無統(tǒng)計學意義(P=0.85)。
　　 8 空白組、陰性組和干擾組三組細胞P-gP蛋白含量分別為(0.868±0.153),(0.796±0.105),(0.764±0.103),三組細胞相比差別無明顯統(tǒng)計學意義(F=1.322,P=0.291)。
　　 9 空白組、陰性組

23、和干擾組三組細胞GST-π的蛋白含量分別為(1.266±0.137),(1.248±0.135),(0.485±0.163),三種細胞相比差別具有統(tǒng)計學意義(F=65.706,P=0.000)。其中干擾組的GST-π水平明顯低于陰性組和空白組(P＜0.05),陰性組和空白組相比差別無統(tǒng)計學意義(P=0.820)。
　　 10 空白組GSH含量為(45.993±5.726)nmol/mg,陰性組GSH含量為(44.971±3.82

24、4)nmol/mg,干擾組GSH含量(24.743±4.659)nmol/mg。三組相比差別具有統(tǒng)計學意義(F=49.876,P=0.000),其中干擾組明顯低于其他兩組(P＜0.05),其他兩組無統(tǒng)計學差異(P=0.674)。
　　 結論:
　　 1 從基因水平及蛋白水平上證實了耐藥細胞株表面的間皮素表達明顯高于敏感細胞株。
　　 2 漿液性卵巢癌細胞株的間皮素表達水平高于粘液性卵巢癌細胞株。
　　 3

25、 間皮素沉默后卵巢癌耐藥細胞對順鉑的敏感性明顯增強,間皮素在一定程度上逆轉順鉑耐藥。
　　 4 間皮素沉默逆轉順鉑耐藥的可能機制:間皮素沉默通過下調GST-π蛋白的表達,降低耐藥細胞內谷胱甘肽的含量,減少谷胱甘肽與順鉑的結合,順鉑作用增強,從而逆轉耐藥。
　　 5 間皮素沉默逆轉耐藥的作用機制較復雜,可能多種因素參與此過程。
　　 第三部分siRNA介導的間皮素沉默聯(lián)合順鉑治療耐藥卵巢癌裸鼠移植瘤的效果
　

26、　 目的:觀察MSLN沉默后裸鼠移植瘤對順鉑敏感性,進一步闡明MSLN在卵巢癌順鉑耐藥中的作用。
　　 方法:建立荷人卵巢癌耐藥細胞裸鼠腹腔移植瘤模型。將SKOV3/cDDP細胞接種于裸鼠腹腔,成瘤后用包裝有間皮素siRNA的慢病毒液和順鉑進行治療,分成六組:干擾組、干擾+cDDP組、陰性組、陰性+cDDP組、空白組和cDDP組。比較6組裸鼠的一般狀況,生存期。裸鼠解剖后比較6組裸鼠的移植瘤數(shù)目和重量,用流式細胞術測定6組裸鼠

27、移植瘤組織的凋亡率,單純由順鉑誘導的凋亡率用AA表示,△A=加順鉑組的凋亡率—加PBS組的凋亡率,用Western Blot測定間皮素的干擾效率。
　　 結果:
　　 1 干擾組的移植瘤數(shù)目及重量均顯著少于陰性組和空白組(P＜0.05),干擾+cDDP組的移植瘤數(shù)目及重量最少,明顯少于其他5組,差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),陰性組的移植瘤數(shù)目及重量與空白組相比差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2 干

28、擾組、陰性組、陰性+cDDP組、空白組和cDDP組的裸鼠均在接種腫瘤細胞后30天內全部死亡,中位生存期分別為28,26,27,25,25天,其中干擾組的中位生存期長于其他4組,差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。干擾+cDDP組的中位生存期為38天,與其他5組相比生存期明顯延長(P=0.000),差別具有統(tǒng)計學意義。
　　 3 干擾組、干擾+cDDP組、陰性組、陰性+cDDP組、空白組和cDDP組移植瘤組織的MSIN蛋白含量分別

29、為0.115、0.121、0.855、0.864、0.876、0.869,干擾組和干擾+cDDP組的干擾率分別為86.87％、86.08％。
　　 4 流式細胞術測凋亡率:干擾組的凋亡率高于陰性組和空白組,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000),干擾+cDDP組的凋亡率明顯高于陰性+cDDP組和cDDP組,差別也具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。陰性組的凋亡率與空白組相比差別無統(tǒng)計學意義(P=0.907),陰性+cDDP組的凋亡率

30、與cDDP組相比差別無統(tǒng)計學意義(P=0.837)。單純由順鉑誘導的凋亡率干擾組(40.96±4.746)％明顯高于陰性組(19.88±4.356)％和空白組(19.26±4.746)％,差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 結論:
　　 1 用包裝有間皮素siRNA的慢病毒載體成功將移植瘤組織間皮素沉默,間皮素沉默本身能抑制腫瘤細胞的生長,促進細胞凋亡,腫瘤生長速度減慢。
　　 2 對于耐藥卵巢癌組織,