大黃素逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥及抑制侵襲作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 大黃素（Emodin）屬蒽醌類衍生物，是大黃、虎杖、首烏等多種中藥的有效成分之一，除了具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，抗菌抗炎等作用外，近年來研究表明，大黃素還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)效應(yīng)。隨著研究的逐步深入，其抗腫瘤作用越來越受到人們的重視。 卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是婦科中的常見惡性腫瘤，其死亡率居?jì)D科腫瘤首位。手術(shù)治療和以紫杉醇、順鉑等為主的聯(lián)合化療方案是目前卵巢癌治療的

2、重要手段。而在臨床治療過程中會(huì)出現(xiàn)由于長(zhǎng)期治療而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，約80％以上的卵巢癌患者在治療后會(huì)出現(xiàn)腫瘤病灶的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，五年存活率僅45％。如何逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞的耐藥及抑制卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移等問題成為卵巢癌治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 紫杉醇（Paclitaxel）是卵巢癌化療的一線藥物，作用機(jī)理是誘導(dǎo)和促進(jìn)微管的裝配，使微管在有絲分裂時(shí)不能形成紡錘體和紡錘體絲，導(dǎo)致快速分裂的腫瘤細(xì)胞在有絲分裂階段（G2

3、/M期阻滯）固定，阻止腫瘤細(xì)胞的分裂和繁殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 本研究分為兩部分： 第一部分：大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞系誘導(dǎo)凋亡和逆轉(zhuǎn)耐藥作用及機(jī)制的研究； 第二部分：大黃素對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞系侵襲能力的抑制作用及其機(jī)制研究。 第一部分：大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞系誘導(dǎo)凋亡和逆轉(zhuǎn)耐藥作用及其機(jī)制的研究 目的： 1.研究大黃素（Emodin）作用于人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和A2780/taxol細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作

4、用； 2.研究大黃素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用；觀察大黃素對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/taxol凋亡的變化； 3.檢測(cè)大黃素作用前后卵巢癌細(xì)胞中耐藥及凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)水平，探討大黃素的作用機(jī)制。 方法： MTT法檢測(cè)不同濃度大黃素（10，20，40，80μM）對(duì)A2780和A2780/taxol的生長(zhǎng)抑制作用；MTT法檢測(cè)低濃度大黃素聯(lián)合紫杉醇作用時(shí)，對(duì)紫杉醇抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/t

5、axol生長(zhǎng)的增強(qiáng)作用；流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)大黃素單獨(dú)或聯(lián)合紫杉醇作用于耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780/taxol的凋亡誘導(dǎo)情況；QRT-PCR檢測(cè)大黃素作用后A2780/taxol細(xì)胞內(nèi)MDR-1、XIAP和survivin基因mRNA表達(dá)；蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)A2780和A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1、XIAP和survivin蛋白的表達(dá)，并檢測(cè)大黃素作用后A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1、XIAP

6、和survivin蛋白表達(dá)；羅丹明外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-gp功能水平的改變。 結(jié)果： 1、大黃素對(duì)A2780和A2780/taxol細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度大黃素作用于卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和A2780/taxol24小時(shí)后的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示：A2780細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：空白對(duì)照組99.81％±3.43％：大黃素10μM組93.85％±4.21％；大黃素20μM組78.17％±1.26

7、％；大黃素40μM組55.90％±7.00％；大黃素80μM組38.91％±3.68％。A2780/taxol細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：空白對(duì)照組98.63％±4.61％；大黃素10μM組93.10％±5.13％；大黃素20μM組75.61％±3.82％；大黃素40μM組57.76％±6.30％：大黃素80μM組36.21％±4.50％。 2、大黃素對(duì)A2780和A2780/taxol細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 應(yīng)用FCM法檢測(cè)

8、不同濃度大黃素作用于卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780/taxol24小時(shí)后的凋亡誘導(dǎo)作用，結(jié)果顯示各組細(xì)胞凋亡率分別為：空白對(duì)照組1.30％；10μM大黃素組5.56％；20μM大黃素組17.66％；40μM大黃素組31.96％；80μM大黃素組41.97％。 3、大黃素與紫杉醇對(duì)A2780和A2780/taxol細(xì)胞的聯(lián)合作用 應(yīng)用MTT法檢測(cè)大黃素（10μM）和紫杉醇（1μM）單獨(dú)或聯(lián)合作用于卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和A2780

9、/taxol24小時(shí)后的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示，A2780細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：空白對(duì)照組100.00％±3.23％；大黃素10μM組95.00％±3.86％：紫杉醇1μM組56.45％±2.93％；大黃素+紫杉醇組43.29％±2.43％。細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：空白對(duì)照組98.80％±3.17％；大黃素10μM組92.34％±1.07％；紫杉醇1μM組81.49％±4.49％；大黃素+紫杉醇組63.60％±2.27％。

10、 4、A2780和A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1、XIAP和survivin的基礎(chǔ)表達(dá) 應(yīng)用Western blot法檢測(cè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780和A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1、XIAP和survivin的基礎(chǔ)表達(dá)，結(jié)果顯示：MDR-1所編碼的P-gp蛋白的表達(dá)在A2780細(xì)胞中非常低，但在A2780/taxol細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。A2780/taxol細(xì)胞中，凋亡抑制蛋白家族的survivin和XIAP的表

11、達(dá)也比在其親本細(xì)胞A2780中表達(dá)明顯升高。 5、大黃素對(duì)A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1、XIAP和survivin基因及蛋白表達(dá)水平的影響應(yīng)用QRT-PCR和Western blot法檢測(cè)大黃素作用后A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1、XIAP和survivin的表達(dá)水平，QRT-PCR結(jié)果用目的基因和內(nèi)參照基因（β-actin）的比值來表示。結(jié)果顯示：空白對(duì)照A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1基因水平為1.2

12、0±0.25，大黃素10μM干預(yù)72小時(shí)后A2780/taxol細(xì)胞中MDR-1基因水平為0.27±0.09（P<0.05）；空白對(duì)照A2780/taxol細(xì)胞中XIAP基因水平為1.77±0.41，大黃素10μM干預(yù)72小時(shí)后A2780/taxol細(xì)胞中XIAP基因水平為0.987±0.20（P<0.05）；空白對(duì)照A2780/taxol細(xì)胞中survivin基因水平為0.086±0.01，大黃素10μM干預(yù)72小時(shí)后A2780/ta

13、xol細(xì)胞中survivin基因水平為0.06±0.01（P<0.05）。Western blot的結(jié)果顯示大黃素作用后MDR-1、XIAP和survivin蛋白的表達(dá)水平降低。羅丹明實(shí)驗(yàn)表明大黃素作用后A2780/taxol細(xì)胞中P-gp蛋白的功能為空白對(duì)照細(xì)胞的32.11％±8.8％（P<0.05）。 結(jié)論： 1、大黃素可以抑制A2780和A2780/taxol細(xì)胞的增殖，具有濃度依賴性； 2、大黃素能誘導(dǎo)A

14、2780和A2780/taxol細(xì)胞凋亡，通過降低MDR-1、XIAP和survivin的表達(dá)，增強(qiáng)紫杉醇耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的藥物敏感性并促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 第二部分大黃素對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞系侵襲能力的抑制作用及其機(jī)制研究 目的： 1、探討A2780/taxol細(xì)胞侵襲能力的改變及相關(guān)機(jī)制； 2、檢測(cè)大黃素對(duì)卵巢癌A2780/taxol細(xì)胞的侵襲抑制作用；并探討大黃素抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力的作用機(jī)制。

15、 方法： 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell）檢測(cè)A2780和A2780/taxol兩種細(xì)胞的侵襲能力；Western blot法檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MIF、MMP-2和MMP-9在A2780和A2780/taxol細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)的差異；Transwell法檢測(cè)不同濃度大黃素（20，40，80μM）作用后卵巢癌A2780/taxol細(xì)胞體外侵襲能力的改變；QRT-PCR法檢測(cè)大黃素作用前后A2780/taxol細(xì)胞中MI

16、F、MMP-2和MMP-9基因mRNA表達(dá)水平的變化；Western-blot法檢測(cè)大黃素作用前后A2780/taxol細(xì)胞中MIF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1、A2780和A2780/taxol細(xì)胞的侵襲能力的檢測(cè) 應(yīng)用Transwell法檢測(cè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A2780和A2780/taxol細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示：每高倍鏡視野中有48±4.64個(gè)A2780細(xì)胞穿透基底膜層，進(jìn)入侵

17、襲小室下層；每高倍鏡視野有92.33±7.40個(gè)細(xì)胞穿透基底膜，進(jìn)入侵襲小室下層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（JP<0.05）。 2、A2780和A2780/taxol細(xì)胞中MIF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平 3、大黃素對(duì)卵巢癌A2780/taxol細(xì)胞侵襲能力的影響 4、大黃素作用于卵巢癌A2780/taxol細(xì)胞后MIF、MMP-2和MMP-9的表達(dá) 結(jié)論： 1、卵巢癌細(xì)胞A2780/taxol的