細胞周期檢測點激酶1在急性白血病細胞耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、腫瘤細胞耐藥是臨床上復(fù)發(fā)性和難治性白血病化療失敗的主要原因之一，經(jīng)典的多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)機制并不能完全解釋腫瘤細胞的耐藥現(xiàn)象及徹底逆轉(zhuǎn)耐藥性。因此，深入研究白血病細胞的耐藥發(fā)生機制并探討逆轉(zhuǎn)策略極其重要。 細胞周期檢測點信號通路是細胞的一種自我保護機制。50％以上的腫瘤細胞因p53基因功能缺陷致使G1/S期檢測點的阻滯作用缺失，當(dāng)細胞受到放化療損傷后，絕大部分停滯在G2/M期，修復(fù)受損的D

2、NA，從而提高腫瘤細胞的抗損傷能力而導(dǎo)致腫瘤的耐藥。 細胞周期檢測點激酶1(checkpointkinase1，Chk1)是G2/M檢測點活化的重要效應(yīng)分子，能直接參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)和細胞凋亡，在維護基因組穩(wěn)定性方面具有較強作用。Chk1的高表達及酶活性升高是導(dǎo)致腫瘤細胞增殖活性和抗凋亡能力增強的重要原因；抑制Chk1表達則增加了諸多化療藥物(如Topo抑制劑、抗代謝類藥物、抗微管類藥物等)的細胞毒效應(yīng)?？梢酝茢啵珻hk1信

3、號通路是影響腫瘤細胞對化療藥物敏感性的關(guān)鍵因素。但在以P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)介導(dǎo)耐藥為主的細胞中，Chk1信號通路是否也發(fā)揮同樣作用尚不清楚。因此，本課題以人紅白血病耐藥細胞株K562/A02(耐阿霉素)為研究對象，探討Chk1對白血病細胞耐藥的調(diào)控機制；隨后應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默Chk1基因，觀察Chk1在白血病細胞耐藥中的作用；并進一步研究聯(lián)合阻斷Chk1信號通路與P-gp泵功能兩條途徑對逆轉(zhuǎn)K562/

4、A02細胞耐藥性的作用，為臨床上克服白血病細胞化療耐藥提供更為有效的作用靶點及治療途徑。 第一部分Chk1引起的G2/M期阻滯在K562/A02細胞耐藥機制中的研究 目的：研究Chk1對白血病細胞周期分布的影響，探討Chk1調(diào)控腫瘤細胞耐藥的機制。 方法：以人紅白血病細胞系K562及其耐藥細胞株為K562/A02研究對象，與阿霉素共同孵育后，流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布，RT-PCR檢測Chk1mRNA表達水平，W

5、estern-blot檢測其蛋白質(zhì)及磷酸化水平的表達。 結(jié)果：阿霉素致K562/A02細胞阻滯在G2/M期的細胞百分率為(54.12±0.57)％，顯著高于K562細胞的(36.99±1.28)％；Chk1mRNA及蛋白表達水平在K562與K562/A02細胞間無顯著差異；Chk1磷酸化水平在K562/A02細胞為0.79±0.56，K562細胞為0.27±1.47，其差異有顯著性意義。 結(jié)論：G2/M期阻滯是導(dǎo)致白血病

6、細胞耐藥的機制之一，Chk1磷酸化水平與G2/M期阻滯密切相關(guān)，提示Chk1的活化狀態(tài)參與調(diào)控白血病細胞耐藥的形成。 第二部分Chk1基因沉默增強K562/A02細胞對阿霉素敏感性的實驗研究 目的：研究Chk1基因沉默對K562/A02細胞生長的影響，探討Chk1在白血病細胞耐藥中的作用。 方法：通過電穿孔轉(zhuǎn)染法將特異性靶向Chk1的短發(fā)卡狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)導(dǎo)入K562/A02

7、細胞，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot檢測細胞內(nèi)Chk1的表達，流式細胞術(shù)(FCM)檢測其細胞周期分布及細胞的凋亡率，MTT法測細胞的增殖。 結(jié)果：與對照組和空載體轉(zhuǎn)染組相比，shRNA使細胞中Chk1mRNA水平下降了66％，蛋白水平下降了60％。抑制Chk1的表達可解除阿霉素引起的G2/M期阻滯；使阿霉素誘導(dǎo)的細胞凋亡率由轉(zhuǎn)染前的(5.67±0.78)％上升到(19.25±1.41)％；在阿霉素濃度0.4mg/L、

8、4mg/L時，細胞的增殖活性分別下降12％、20％。 結(jié)論：靶向Chk1的shRNA能有效下調(diào)Chk1的基因表達，繼而解除阿霉素誘導(dǎo)的G2/M阻滯，促進細胞凋亡及增強K562/A02細胞對阿霉素的敏感性，提示抑制Chk1表達是逆轉(zhuǎn)白血病細胞化療耐藥的靶點之一。 第三部分Chk1shRNA聯(lián)合環(huán)胞素A逆轉(zhuǎn)K562/A02細胞耐藥的實驗研究 目的：研究聯(lián)合阻斷Chk1信號通路與P-gp泵功能兩條途徑對逆轉(zhuǎn)K562/A

9、02細胞耐藥性的作用，探索有效的克服白血病細胞耐藥的策略。 方法：MTT法測定CsA的非細胞毒性劑量；Chk1shRNA與CsA聯(lián)用后，MTT法檢測細胞的藥物敏感性；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、細胞周期及細胞內(nèi)阿霉素濃度的變化。 結(jié)果：CsA濃度低于2.95±0.39mg/L時對K562/A02細胞的生長抑制率小于10％。Chk1shRNA聯(lián)合CsA(1mg/L)使阿霉素對K562/A02細胞的IC50值由原來的109.65

10、±0.26mg/L降至2.44±0.51mg/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為45倍，明顯增加了細胞敏感性；細胞凋亡率升至(66.74±1.62)％，與Chk1shRNA或CsA單獨處理組相比有顯著差異。Chk1shRNA與CsA單獨或聯(lián)用均導(dǎo)致G2/M期細胞百分率顯著下降，分別為(17.10±0.63)％、(14.60±0.97)％、(18.21±1.13)％，三者間無顯著差異，但聯(lián)用組有明顯的亞G1峰。Chk1shRNA聯(lián)合CsA組細胞內(nèi)阿霉素濃度為