SCD1表達(dá)與高脂誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、本研究分為三章： 第一章、SCD1 與高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性 目的:研究SCD1 在高脂飲食大鼠肝臟的表達(dá)及其與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。 方法:30 只SD 大鼠隨機(jī)分成正常組、高脂組，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)的第8w，16w和24w 分批處死。HE 染色觀察肝細(xì)胞組織學(xué)改變，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測(cè)SCD1 mRNA和SPT mRNA的表達(dá)，TUNEL 方法觀察肝細(xì)胞的凋

2、亡。 結(jié)果:肝組織HE 染色顯示高脂組大鼠肝臟8w 即達(dá)到脂肪肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR 分析結(jié)果顯示高脂組SCD1 mRNA 表達(dá)下降，SPT mRNA 表達(dá)進(jìn)行性上升。TUNEL 凋亡檢測(cè)表明，隨著高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，肝細(xì)胞凋亡加重。SCD1 表達(dá)與SPT和凋亡指數(shù)（AI）呈負(fù)相關(guān)，SPT 表達(dá)和AI 指數(shù)呈正相關(guān)。 結(jié)論:長(zhǎng)期高脂飲食可引起肝SCD1 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因SPT的表達(dá)，肝細(xì)胞凋亡增多。

3、 第二章、SCD1 重組慢病毒載體構(gòu)建 目的:構(gòu)建含有大鼠肝臟SCD1基因的重組慢病毒載體pGC-FU-SCD1-GFP，為進(jìn)一步研究SCD1基因在大鼠肝細(xì)胞凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法:TRIZOL 法抽提大鼠肝臟總RNA，RT 得到cDNA。根據(jù)Gene-Bank中已經(jīng)公布的SCD1基因序列，設(shè)計(jì)SCD1 鉤取引物，PCR 擴(kuò)增SCD1 目的基因。SCD1基因克隆到慢病毒載體pGCFU質(zhì)粒中。重組質(zhì)粒經(jīng)Age

4、1 酶切、PCR、及測(cè)序鑒定后，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)及Western Blotting 檢測(cè)SCD1蛋白的表達(dá)。最后經(jīng)293T細(xì)胞包裝擴(kuò)增后得到攜帶SCD1基因的重組慢病毒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并對(duì)SCD1蛋白鑒定。 結(jié)果:PCR、酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)目的基因正確克隆至慢病毒質(zhì)粒pGC-FU中。293T細(xì)胞包裝出病毒顆粒的滴度為2×109TU/ml。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后經(jīng)熒光顯微鏡可觀察到GFP的表達(dá)，

5、Western Blotting 檢測(cè)可見(jiàn)SCD1蛋白的表達(dá)。 結(jié)論:過(guò)表達(dá)SCD1 重組慢病毒載體成功構(gòu)建。 第三章、SCD1 過(guò)表達(dá)影響大鼠BRL 肝細(xì)胞系凋亡機(jī)理 目的:探討SCD1 過(guò)表達(dá)影響大鼠BRL 肝細(xì)胞系凋亡作用的可能途徑。 方法:通過(guò)臺(tái)盼蘭染色檢測(cè)軟脂酸誘導(dǎo)BRL 肝細(xì)胞死亡率確定下游實(shí)驗(yàn)軟脂酸添加濃度。預(yù)試驗(yàn)測(cè)定慢病毒載體在大鼠BRL 肝細(xì)胞系中表達(dá)的MOI 值。培養(yǎng)細(xì)胞分組為：非加藥

6、組和加藥組。非加藥組包括一般培養(yǎng)細(xì)胞組（CON）、一般培養(yǎng)加陰性病毒對(duì)照組（NC）及一般培養(yǎng)過(guò)表達(dá)病毒組（SCD1-LV）；加藥組包括一般培養(yǎng)加軟脂酸組（CON+）、一般培養(yǎng)加陰性病毒和軟脂酸組（NC+）及一般培養(yǎng)加過(guò)表達(dá)病毒和軟脂酸組（SCD1-LV+）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)SCD1 mRNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)SPT mRNA 表達(dá)的變化，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化，用膜電位正常細(xì)胞百分比（JC-1+％）表示膜電位

7、改變，PI 單染檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡及周期分析。 結(jié)果:與對(duì)照組相比，400μmol/L的軟脂酸誘導(dǎo)72h細(xì)胞死亡率顯著上升。病毒在BRL 肝細(xì)胞的復(fù)感染指數(shù)(MOI)為20。SCD1-LV組SCD1 表達(dá)明顯上升。軟脂酸誘導(dǎo)引起CON+和NC+組SCD1 表達(dá)的下降、SCD1-LV+組SCD1表達(dá)明顯上升；CON+和NC+組SPT 表達(dá)升高，SCD1-LV+組SPT的表達(dá)則有一定的下降；CON+和NC+組JC-1+％較低，SCD1