心肌缺血再灌注損傷中SyntaxiN-1A的作用及保護(hù)性藥物篩選.pdf

1、背景:圍術(shù)期心臟缺血再灌注損傷(IRI)發(fā)生率高，在非心臟手術(shù)中的發(fā)生率也達(dá)到1％-4％，而且預(yù)后不良，增加了住院病人的發(fā)病率和死亡率。多種方法和藥物，包括缺血預(yù)處理(IPC)和腺苷(adenosine)等，都用于減少圍術(shù)期心肌缺血再灌注的發(fā)生以改善病人的預(yù)后。除此之外，吸入性全麻藥如異氟烷和七氟烷也具備心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。然而吸入性全麻藥和缺血預(yù)處理的作用機(jī)制仍不清楚，而且對(duì)于臨床圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷仍缺乏有效的治療手段

2、。
　　吸入性全麻藥和缺血預(yù)處理通過(guò)相似的細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮作用，例如PI3K/AKT/GSK3β，ERK1/2，JNK/STAT3，PKC，KATP通道等。這些現(xiàn)象提示可能存在同時(shí)受這兩種方法調(diào)控的心肌保護(hù)靶點(diǎn)。近期的研究表明，膜蛋白syntaxin-1A可能就是其中之一。本課題擬研究syntaxin-1A在心肌缺血再灌注損傷中的作用，并探索新型缺血再灌注損傷的治療手段。
　　第一部分 Syntaxin-1A介導(dǎo)了異氟烷預(yù)處

3、理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:Syntaxin-1A廣泛的分布在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心臟和其他各組織器官。研究發(fā)現(xiàn)，syntaxin-1A能夠調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的信號(hào)通路，如KATP通道和鈣離子通道的開(kāi)放。Syntaxin-1A在組織缺血時(shí)表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示syntaxin-1A在心肌缺血再灌注損傷中的作用。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)吸入性全麻藥異氟烷和氟烷能夠與膜蛋白syntax in-1A結(jié)合。本研究假設(shè)

4、一:缺血再灌注損傷、缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理能夠調(diào)控心肌syntaxin-1A表達(dá)水平。假設(shè)二:心肌細(xì)胞syntaxin-1A表達(dá)水平變化能夠影響缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理產(chǎn)生的心肌缺血再灌注保護(hù)作用。假設(shè)三:syntaxin-1A通過(guò)調(diào)節(jié)上述PI3K/AKT/GSK3β，ERK1/2,JNK/STAT3，PKC信號(hào)通路的活化來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為五組:SHAM（對(duì)照組）;Iso（異氟烷組，1.5％）;IR（缺血再灌注

5、組）;IPC（缺血預(yù)處理組）;Iso-PC（異氟烷預(yù)處理組）。并利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染干擾或過(guò)表達(dá)原代心肌細(xì)胞中syntaxin-1A的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)一:通過(guò)SD大鼠在體心肌缺血再灌注模型和原代細(xì)胞離體缺氧復(fù)氧模型的建立，利用western blot觀察再灌注4小時(shí)和24小時(shí)后syntaxin-1A在各處理組中表達(dá)水平的變化，并檢測(cè)心肌損傷指標(biāo)，包括血清肌鈣蛋白cTnT，細(xì)胞活力，和細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)二:利用大鼠原代心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧模型，通

6、過(guò)重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)或下調(diào)syntaxin-1A的表達(dá)水平，觀察各實(shí)驗(yàn)組原代細(xì)胞缺氧損傷的變化。采用MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力;采用流式細(xì)胞儀AnnexinⅤ-APC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)三:Syntaxin-1A保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的通路機(jī)制研究。采用western blot技術(shù)檢測(cè)上調(diào)或下調(diào)syntaxin-1A表達(dá)水平后，心肌保護(hù)性信號(hào)通路的活化情況，包括ERK1/2、AKT、GSK3β和STAT3磷酸化活化程度;PKC

7、蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:在體和細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，缺血再灌注損傷能使心肌syntaxin-1A表達(dá)上調(diào)，而缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理能使syntaxin-1A的表達(dá)進(jìn)一步上升。實(shí)驗(yàn)二:利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控syntaxin-1A的表達(dá)水平能夠影響缺氧復(fù)氧損傷誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力;同時(shí)，利用siRNA技術(shù)降低syntaxin-1A的表達(dá)能夠阻斷異氟烷預(yù)處理產(chǎn)生的心臟保護(hù)效應(yīng)，但對(duì)缺血預(yù)處理的作用影響

8、不大。實(shí)驗(yàn)三:缺血再灌注損傷能上調(diào)ERK1/2，STAT3，AKT和GSK3β的磷酸化水平以及PKC的表達(dá)水平;同時(shí)，syntax in-1A表達(dá)下調(diào)后能明顯激活PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路，但上調(diào)其表達(dá)對(duì)PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路影響不大。
　　結(jié)論:Syntaxin-1A能夠?qū)π募∪毖俟嘧p傷產(chǎn)生保護(hù)作用，并且可能是異氟烷預(yù)處理發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的的靶蛋白。Syntaxin-1A的表達(dá)調(diào)控與PI

9、3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路的活化相關(guān)。
　　第二部分二次缺氧損傷保護(hù)性藥物的高通量篩選
　　目的:在缺血損傷發(fā)生后，兩種完全不同的病理生理學(xué)過(guò)程造成了組織細(xì)胞的死亡。細(xì)胞自發(fā)的死亡機(jī)制在前期已經(jīng)得到很好的研究和闡述，包括細(xì)胞的壞死和凋亡等。另一方面，缺血后已經(jīng)死亡的細(xì)胞可以釋放小分子來(lái)促進(jìn)周圍細(xì)胞的死亡。鉀離子和谷氨酸被證明從缺氧損傷的神經(jīng)元釋放并誘發(fā)周圍神經(jīng)元的死亡。這種缺氧損傷后細(xì)胞的非自發(fā)性死亡被稱為“二次缺氧損

10、傷”。這種現(xiàn)象在臨床上被認(rèn)為更加重要，因?yàn)檫@些細(xì)胞遭受缺氧損傷指出仍然是存活的，例如腦卒中的“半影區(qū)(Penumbra)”和心梗中的危險(xiǎn)區(qū)域(Area at Risk，AAR)。
　　目前在臨床上圍術(shù)期缺血再灌注損傷發(fā)生后，仍缺乏有效的治療措施。前瞻性藥物篩選方法能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)未知藥物和藥物的未知功能提供可能性。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)一:構(gòu)建針對(duì)二次缺氧損傷保護(hù)性藥物的高通量篩選模型。實(shí)驗(yàn)二:利用構(gòu)建的高通量篩選模型篩選具有二次缺氧損傷保

11、護(hù)作用的潛在藥物。
　　方法:研究采用了秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C.elegans)突變型蟲系gc47∶gcIs3作為動(dòng)物模型。該蟲系具有rars-1(gc47)突變背景，但咽部表達(dá)野生型基因。該突變型gc47是位于秀麗隱桿線蟲3號(hào)染色體左臂上編碼rrt-1基因的第811核苷酸甘氨酸殘基(G)突變?yōu)楸彼釟埢?A)，使精氨酸-tRNA合成酶的功能降低，從而蛋白合成效率降低。突變型gc47對(duì)缺氧有

12、出色的耐受性，而gc47∶gcIs3蟲系在缺氧損傷后的4-6天里逐漸受損乃至死亡。本部分實(shí)驗(yàn)一:利用秀麗隱桿線蟲突變型蟲系gc47∶gcIs3構(gòu)建二次缺氧損傷高通量篩選的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)二:選取MicrosourceDiscovery System公司的Spectrum Collection化合物庫(kù)，包含2000種不同的藥物，其中包括1000種臨床藥物，580種自然提取物和420種具有生物活性的化合物。利用已構(gòu)建的高通量篩選模型，尋找對(duì)二

13、次缺氧損傷具有保護(hù)作用的潛在藥物。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:通過(guò)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了一套以突變型gc47∶gcIs3蟲系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的高通量藥物篩選模型。缺氧時(shí)間27小時(shí)為最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間;缺氧后96小時(shí)后為評(píng)價(jià)時(shí)間節(jié)點(diǎn);評(píng)價(jià)指標(biāo)包括線蟲的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、大小等;并通過(guò)小型篩選實(shí)驗(yàn)成功篩選出陽(yáng)性對(duì)照藥物多西環(huán)素。實(shí)驗(yàn)二:經(jīng)過(guò)第一輪篩選，從2000種藥物中得到125種具有潛在保護(hù)作用的藥物;從中選取80種藥物，建立濃度梯度，進(jìn)行第二次篩選，得到