Notch信號(hào)通路與淋巴細(xì)胞發(fā)育的相關(guān)研究.pdf

1、T，B淋巴細(xì)胞是機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答的重要組成部分，她們的正常發(fā)育是機(jī)體對外來微生物入侵產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)，其異常的發(fā)育則是自身免疫性疾病的基本病因之一。解開他們的發(fā)育過程及分子機(jī)制之謎一直是免疫學(xué)家孜孜以求的目標(biāo)。其發(fā)育過程是細(xì)胞分化，增殖和凋亡等多種基本生命現(xiàn)象協(xié)同作用的結(jié)果，涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。 Notch信號(hào)途徑是通過膜表面受體介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間相互作用，來調(diào)節(jié)前體細(xì)胞和干細(xì)胞的分化方向，從而調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞間分化的

2、基本信號(hào)途徑之一。它在進(jìn)化中高度保守，在從線蟲到人，從胚胎發(fā)育到成年個(gè)體的多種系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要作用。Notch信號(hào)通路通過調(diào)控前體細(xì)胞的分化方向，在淋巴細(xì)胞發(fā)育中同樣發(fā)揮著重要作用。這已在淋巴細(xì)胞發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)如T/B 細(xì)胞的分化、脾臟中邊緣帶B細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞的分化中得到證實(shí)。但Notch信號(hào)途徑在淋巴細(xì)胞發(fā)育其他環(huán)節(jié)中的作用并不清楚，而在已知可發(fā)揮作用的環(huán)節(jié)中的分子機(jī)制也為未解之謎。值得注意的是，哺乳類的四種Notch受體都需要轉(zhuǎn)

3、錄因子RBP-J介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄激活活性，將其敲除可以阻斷4種Notch受體的信號(hào)，從而獲得完全的Notch信號(hào)通路的loss of function的模型。 為進(jìn)一步研究Notch信號(hào)途徑在T 淋巴細(xì)胞發(fā)育和功能中的作用，基于組織特異性剔除Cre-LoxP系統(tǒng)的原理，我們建立了在T細(xì)胞中特異性剔除RBP-J的條件性剔除小鼠—Lck-Crex RBP-Jflox/flox小鼠，并對它們進(jìn)行了初步的表型分析。為此，我們構(gòu)建了在T 細(xì)胞

4、中特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pLck-Cre，通過顯微注射方法，建立了共20系Lck-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。我們將這些小鼠分別與本室擁有的RBP-J條件性剔除小鼠進(jìn)行交配，并采用Southern Blot對不同Lck-Cre來源的Lck-Cre x RBP-Jflox/＋雜合子小鼠的胸腺細(xì)胞中RBP-J的剔除效率進(jìn)行了鑒定，最終鑒定得到胸腺細(xì)胞中RBP-J被完全剔除的兩系小鼠－M5 Lck-Cre，M19 Lck-Cre。我們進(jìn)

5、一步將這兩系小鼠來源的基因型為Lck-Cre x RBP-Jflox/＋的雜合子小鼠進(jìn)行交配，以獲得Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠進(jìn)行表型分析。 對M19 Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠的表型分析結(jié)果顯示，剔除小鼠胸腺細(xì)胞中αβT細(xì)胞發(fā)育和γδ T細(xì)胞發(fā)育均未見異常。AnnexinV染色顯示剔除小鼠胸腺中DP細(xì)胞（CD4+CD8+）的凋亡增加，提示了Notch/RBP-J信號(hào)通路在胸

6、腺細(xì)胞中的抗凋亡作用。另發(fā)現(xiàn)脾臟中RBP-J缺失的CD4 T細(xì)胞的體外增殖能力減弱，提示Notch信號(hào)通路可促進(jìn)外周CD4 T細(xì)胞的增殖，而且此過程是RBP-J依賴的。M5 Lck-Cre x RBP-Jflox/flox小鼠的表型分析結(jié)果顯示，純合子小鼠胸腺中αβT細(xì)胞發(fā)育受阻，但γδ T細(xì)胞的發(fā)育未見異常，這提示Notch/RBP-J信號(hào)通路對αβT細(xì)胞的早期發(fā)育具有促進(jìn)作用。 本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)Notch/RBP-J

7、信號(hào)通路還決定了脾臟中B細(xì)胞的分化命運(yùn)，可促進(jìn)邊緣帶B細(xì)胞的發(fā)育而抑制前體細(xì)胞向?yàn)V泡B細(xì)胞的分化，但下游靶基因并不清楚。為此，我們對脾臟中這兩群來自于共同前體細(xì)胞的B細(xì)胞亞群－邊緣帶B細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)譜的對比分析，結(jié)果顯示，共有1226個(gè)基因在濾泡B細(xì)胞高表達(dá)，而1754個(gè)基因在邊緣帶B細(xì)胞中高表達(dá)。我們對所有差異表達(dá)的基因進(jìn)行了注釋、功能分類以及進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的一系列分子包括膜表面受體Notch2，

8、胞漿內(nèi)的調(diào)節(jié)蛋白Deltex及負(fù)調(diào)控分子MINT，在兩群B細(xì)胞中均呈差異表達(dá)。與以往的分析一致，Notch信號(hào)通路表現(xiàn)為在邊緣帶B細(xì)胞中的高度活化。另外，已知Hes家族分子是Notch信號(hào)通路的主要的下游靶基因，芯片結(jié)果提示Hes家族成員分子之一Hes5只表達(dá)于邊緣帶B細(xì)胞，在濾泡B細(xì)胞并不表達(dá)，這提示我們Hes5很可能是Notch/RBP-J信號(hào)通路調(diào)控外周B細(xì)胞分化的直接的下游靶基因。 隨后，我們圍繞兩群B細(xì)胞差異表達(dá)的膜表

9、面分子和受體展開了一些工作。 首先，基于芯片結(jié)果的提示和后續(xù)的流式細(xì)胞分析，我們發(fā)現(xiàn)CD36，一種B型清道夫受體，在邊緣帶B細(xì)胞中高表達(dá)，而在濾泡B細(xì)胞中幾乎不表達(dá)；CD68,CD49e在濾泡B細(xì)胞中不表達(dá)，在邊緣帶B細(xì)胞中以較低水平表達(dá)；CD44在兩群B細(xì)胞中都表達(dá)，在邊緣帶B細(xì)胞中的表達(dá)水平高于濾泡B細(xì)胞。其中CD36因?yàn)槠涮禺惖谋磉_(dá)模式，可以作為邊緣帶B細(xì)胞的新的表面標(biāo)志。CD36參與脂肪代謝，參與巨噬細(xì)胞對P. Falc

10、iparum 感染的紅細(xì)胞,凋亡的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的吞噬，它在邊緣帶B細(xì)胞中的特異表達(dá)可能與這群B細(xì)胞在先天性免疫應(yīng)答中對血源播散性病原體的清除有關(guān)。 另外，我們發(fā)現(xiàn)兩群B細(xì)胞呈現(xiàn)多種細(xì)胞因子受體的差異表達(dá)，這與兩群B細(xì)胞對細(xì)胞因子的差異應(yīng)答有關(guān)。其中，與在對胸腺依賴性抗原應(yīng)答的作用相一致，濾泡B細(xì)胞高表達(dá)CD124分子；而半定量RT-PCR的結(jié)果顯示邊緣帶B細(xì)胞具有較高水平的CD131的mRNA，可能與邊緣帶B細(xì)胞受到刺激后

11、的快速活化有關(guān)。 最后，芯片結(jié)果提示趨化因子受體CXCR7在兩群B細(xì)胞中呈差異表達(dá)。為進(jìn)一步闡明該受體在介導(dǎo)邊緣帶B細(xì)胞定位中的作用，我們制備了抗趨化因子受體CXCR7的抗血清，發(fā)現(xiàn)CXCR7在骨髓，脾臟，淋巴結(jié)，腹腔等多種淋巴器官的B細(xì)胞上均有表達(dá)，但在T細(xì)胞表面沒有表達(dá)。在脾臟中，在新生B細(xì)胞的表面沒有表達(dá)，在濾泡B細(xì)胞和邊緣帶B細(xì)胞中均有表達(dá)，在后者中的表達(dá)較高于前者。CXCR7在腹腔中的兩群B細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，在B1

12、細(xì)胞中的表達(dá)高于在B2細(xì)胞中的表達(dá)，可能和B1細(xì)胞的特殊定位以及在天然免疫應(yīng)答中的作用有關(guān)。 綜上，我們建立了在T細(xì)胞中特異性剔除Notch信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J的條件性剔除小鼠，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)Notch/RBP-J信號(hào)通路在體內(nèi)可抑制胸腺細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)外周CD4 T細(xì)胞的增殖，這些研究進(jìn)一步揭示了該信號(hào)通路的體內(nèi)功能。另外，我們對濾泡B細(xì)胞和邊緣帶B細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)譜的對比分析，進(jìn)一步的注釋分析提示Hes家族成員分