Nell-1基因修飾的組織工程化骨修復頜骨缺損的實驗研究.pdf

1、修復下頜骨臨界缺損(critical-size defect,CSD)是口腔臨床醫(yī)學亟待解決的難題.用組織工程方法進行人工骨修復,被認為是未來骨缺損修復和骨再造的有效方法之一.Nel樣I型分子基因(Nel-like,type 1molecule,Nell-1)作為一種新克隆的成骨相關(guān)基因,具有安全性以及明顯的成骨作用.迄今尚無Nell-1作為成骨相關(guān)因子在組織工程修復下頜骨的報道. 本文應(yīng)用分子生物學和組織工程的方法,通過腺病毒

2、介導的Nell一1基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,bMSCs),研究Nell-1基因?qū)MSCs增殖及成骨分化的影響,構(gòu)建Nell-1基因轉(zhuǎn)染的bMSCs與β-磷酸三鈣(β-tricalcitim phosphate,β-TCP)支架材料復合形成的組織工程化骨,進行裸鼠體內(nèi)及大鼠自體下頜骨CSD修復的研究. 材料與方法：1.貼壁法培養(yǎng)Fisher 344大鼠bMSCs并進行成骨分化

3、誘導,體外應(yīng)用腺病毒載體進行Nell-1基因轉(zhuǎn)染并檢測轉(zhuǎn)染效率.反轉(zhuǎn)錄PCR和Westernblot證實基因表達2.體外轉(zhuǎn)染基因后繪制細胞生長曲線,Von Kossa硝酸銀法檢測鈣結(jié)節(jié)形成,堿性磷酸酶(alkaline plosphatase,ALP)定量測定和放射免疫法測定骨鈣素(osteocalcin,OC)含量檢測成骨細胞表型.實時熒光PCR(Real-time PCR)檢測成骨相關(guān)基因的表達.3.轉(zhuǎn)染目的基因的bMSCs β-T

4、CP支架材料復合構(gòu)建組織工程化骨植入裸鼠體內(nèi),4周后進行HE染色觀察并進行成骨面積分析.4.創(chuàng)建直徑為5mm,全層骨膜骨質(zhì)缺損的圓形大鼠下頜骨CSD模型,Nell-1基因轉(zhuǎn)染的bMSCs復合β-TCP對缺損進行修復,術(shù)后4周、8周取材,行組織學觀察,對標本進行成骨面積分析和Micro-CT掃描. 結(jié)果： 1.貼壁法對Fischer 344大鼠的bMSCs進行增殖和成骨分化誘導培養(yǎng).bMSCs經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染可獲得較高的轉(zhuǎn)染效

5、率,使在正常bMSCs中不表達的Nell-1基因有轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達. 2.感染復數(shù)(Multiply of Infection,MOI)=80空斑形成單位(plagueforming unit,pfu)/cell時,Nell-1基因使細胞增殖速度減緩,ALP表達增強,鈣結(jié)節(jié)數(shù)目增加,OC表達增強.Nell-1使ALP早期抑制,中期和晚期上調(diào),OC晚期上調(diào),骨橋蛋白(OP)和骨涎蛋白(BSP)上調(diào),Sox9下調(diào). 3.

6、bMSCs復合β-TCP材料構(gòu)建的組織工程化骨在裸鼠體內(nèi)生長良好,裸鼠體內(nèi)植入4周后,轉(zhuǎn)染:Nell-1基因的試驗組新骨面積百分比達到34.1﹪±5.4﹪,大于未轉(zhuǎn)染bMSCs組的18.2﹪±3.0﹪和轉(zhuǎn)染LacZ基因組的18.8﹪±3.8﹪(p<0.05). 4.構(gòu)建的組織工程化骨在缺損模型內(nèi)生長良好.修復后4周和8周轉(zhuǎn)染Nell-1 基因的試驗組新骨面積百分比達到28.63﹪±5.03﹪和60.59﹪±8.26﹪,均大于未轉(zhuǎn)

7、染 bMSCs 組的 16.72﹪±0.81﹪,34.74﹪±4.40﹪和轉(zhuǎn)染 LacZ 基因組的 17.29﹪±1.44﹪,38.81﹪±3.82﹪(p<0.05). 結(jié)論： 1.腺病毒載體可有效的轉(zhuǎn)染Nell-1基因并使其獲得表達. 2.MOI=80pfu/cell時,Nell-1基因促進大鼠bMSCs在體外培養(yǎng)時獲得成骨分化表型并抑制細胞增殖.Nell-1基因?qū)Υ笫骲MSCs成骨相關(guān)基因的影響經(jīng)與文獻比較,