雷帕霉素對卵清蛋白誘導引起的哮喘肺部炎癥的保護作用及其免疫機制研究.pdf

1、支氣管哮喘(asthma，簡稱哮喘)是一種由多種細胞和炎癥因子參與的慢性氣道炎癥疾病，表現(xiàn)為可逆性氣道阻塞、氣道高反應性(AirwayHyperresponsiveness，AHR)、氣道炎癥細胞浸潤、特定炎癥因子表達量增高和氣道重塑、氣道粘液分泌等。目前還存在許多難治性哮喘患者因為對一些常規(guī)治療哮喘的藥物不敏感，從而導致患者病情進行性加重，最后發(fā)展成為重癥哮喘，給家庭社會都帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。因此，進一步研究哮喘疾病發(fā)生發(fā)

2、展的分子機制，探索有效的治療藥物，對提高難治性哮喘患者的生存率、減輕肺功能的損傷意義深遠。
　　 以往被普遍認為哮喘的主要發(fā)病機制之一是Th2免疫反應站優(yōu)勢的Th1/Th2免疫反應失衡。流行病學調(diào)差顯示：近些年來，許多不典型哮喘病例的發(fā)病有增高趨勢?？茖W家們針對目前的現(xiàn)狀深入開展了許多科學研究，隨著一些新型Th細胞群(如Th17以及Treg細胞)的發(fā)現(xiàn)以及對其功能的研究，使得人們對哮喘發(fā)病機制的認識也更上一個臺階了，從過往的經(jīng)典

3、的Th1/Th2失衡機制逐漸轉(zhuǎn)換為多類Th細胞群(Th1、Th2、Th9、Th17以及Treg細胞)參與的免疫失調(diào)機制。
　　 雷帕霉素(Rapamycin或RAPA)是一種新型的大環(huán)內(nèi)脂類免疫抑制劑，起初雷帕霉素被研究作為低毒性的抗真菌藥物，1977年發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有免疫抑制作用，隨著對它的深入研究，我們了解到它通過不同的細胞因子受體阻斷信號傳導，阻斷T淋巴細胞及其他細胞由G1期至S期的進程，從而發(fā)揮免疫抑制效應。1989年開

4、始把RAPA作為治療器官移植的排斥反應的新藥進行試用。近10年來，也有文獻報道RAPA能夠抑制哮喘小鼠氣道炎癥，但是對哮喘炎癥抑制效應的分子機制還不明確。本研究主要通過建立哮喘小鼠模型，觀察雷帕霉素對哮喘小鼠氣道炎癥的影響及其可能免疫機制，一期望為臨床治療難治性哮喘的新藥開發(fā)提供新的干預方向。
　　 目的：構建卵清蛋白誘導引起的急性哮喘的動物模型，探索雷帕霉素在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用及其相關免疫機制。
　　 方法：6-

5、8周齡的C57BL/6雌性小鼠按體重大小編號，根據(jù)隨機數(shù)字表產(chǎn)生隨機數(shù)字，按照隨機數(shù)字大小分組，將實驗小鼠平均分為SHAM組、SHAM+RAPA組、OVA組和OVA+RAPA組。SHAM組給予PBS致敏霧化，RAPA組為小鼠PBS或者OVA霧化前1小鼠腹腔注射雷帕霉素(1mg/kg)。觀察各組小鼠肺泡支氣管灌洗液中細胞總數(shù)、分類細胞計數(shù)、病理學檢測；采用熒光定量PCR測肺、脾臟組織中炎癥因子以及炎癥因子受體的表達；采用ELISA的方法檢

6、測肺組織勻漿中炎癥因子的表達；采用流式細胞術檢測肺組織中CD4+T細胞和CD4+IL-17A+T細胞比例和數(shù)量的改變；采用流式細胞術檢測肺、胸腺和淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+T細胞的比例和數(shù)量的改變。
　　 結(jié)果：本實驗利用卵清蛋白致敏霧化構建急性哮喘模型。通過對SHAM組和OVA組的BALF細胞數(shù)、肺組織病理學以及炎癥因子表達等多項指標的檢測，符合急性哮喘模型的特征，提示造模成功。通過霧化前1h腹腔注射RAPA實驗系統(tǒng)性給藥，

7、與OVA組相比，RAPA干預哮喘小鼠之后，BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞以及淋巴細胞比例和絕對數(shù)量均有明顯下降(P<0.001)，抗原暴露引起的中性粒細胞數(shù)量增高的現(xiàn)象也在RAPA干預之后明顯減少，又統(tǒng)計學差異(P<0.05)；肺組織病理學HE染色結(jié)果提示：RAPA干預哮喘小鼠之后明顯減少支氣管血管之間的炎癥細胞浸潤，支氣管上皮增生肥厚現(xiàn)象也明顯改善(P<0.01)，值得注意的是RAPA干預基礎狀態(tài)下的實驗小鼠，能刺激之氣管上皮增生肥

8、厚(P<0.05)；肺組織病理學PAS染色結(jié)果提示：RAPA干預之后，抗原誘導的肺組織內(nèi)粘液分泌增多受到抑制，表現(xiàn)為PAS陽性顆粒數(shù)明顯減少(P<0.001)，Q-PCR檢測粘蛋白Muc5AC的基因表達水平也被RAPA干預抑制(P<0.05)；炎癥因子(如IL-13、IL-17A、IL-25)以及炎癥因子受體(IL-17RB)的mRNA表達下調(diào)(P<0.05)；肺組織勻漿中炎癥因子(IL-17A和IL-6)下調(diào)(P<0.05)；流式細胞