活性氧與SLE外周血單核細胞來源的樹突狀細胞細胞因子分泌、抗原遞呈能力的關聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)、多器官、臨床表現(xiàn)復雜、病程遷延反復的自身免疫性疾病，對患者的身心健康造成較大危害，是一個重要的公共衛(wèi)生問題。盡管SLE的發(fā)病機制未完全闡明，但已有的證據表明，疾病的發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素相關，引起機體免疫異常，尤其是免疫細胞表達和（或）功能紊亂：如對自身抗原的耐受失衡，自身反應性的T淋巴細胞和B淋巴細胞活化紊亂，細

2、胞因子功能發(fā)揮失控以及針對抗雙鏈DNA、核小體、核蛋白的自身抗體過度產生。由此導致的自身反應性抗體大量聚集會引起補體活化、免疫復合物沉積，最終引起組織和（或）器官損傷。
　　樹突狀細胞（dendritic cell，DC）廣泛表達于體內，通常起著免疫監(jiān)視、抗原遞呈和免疫耐受的作用。DC作為特殊的“哨兵細胞”，在固有免疫與適應性免疫間起著重要的橋梁作用。DC表達特殊的模式識別受體，如Toll樣受體，C型凝集素受體，RIG-I樣受體以

3、及 NOD樣受體。DC通?？梢苑譃閮纱箢悾簼{細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid DC,pDC）和常規(guī)樹突狀細胞（conventional DC，cDC）。DC的模式識別受體通過結合到微生物的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern molecules，PAMPs）或者內源性分子的損傷相關分子模式（damage-associated molecular pattern molec

4、ules，DAMPs），以捕獲抗原。當DC成功捕獲抗原后，DC將歷經成熟：（1）上調表面分子和共刺激分子的表達；（2）啟動和調節(jié)T淋巴細胞和B淋巴細胞的功能；（3）分泌一些細胞因子，從而調控和極化其他效應分子的功能。DC可以通過幾種方式影響SLE的發(fā)病，如遞呈自身抗原給自身反應性T淋巴細胞，產生促炎性細胞因子。SLE與MHC單倍體顯著相關，表明T淋巴細胞應答在疾病的形成中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)狼瘡鼠體內TLR7過表達會加劇疾病的發(fā)生、

5、發(fā)展，這一過程與固有刺激啟動相關，并且完全依賴于MHC單倍型，提示DC可能參與了遞呈染色質和RNA相關的蛋白質給自身反應性T淋巴細胞。活化的cDC能產生IL-12p70，而IL-12p70會促進T淋巴細胞中IFNγ的形成，這將導致初始T淋巴細胞分化成Th1細胞；pDC能產生I型干擾素，而I型干擾素會促進cDC成熟，降低使Toll樣受體活化的閾值。因此，DC在SLE發(fā)病中可以通過影響炎癥性細胞因子的產生而起作用。
　　活性氧（rea

6、ctive oxygen species,ROS）包括很多分子實體，如非自由基氧化劑H2O2，NO衍生的過氧亞硝酸鹽，或者含未成對電子的自由基，如羥基自由基、NO和超氧。細胞內的NADPH氧化酶在受到外界刺激后會產生ROS，胞內物質如過氧化物酶和線粒體在氧代謝時所產生的生化反應也會產生ROS。已有研究表明，ROS對信號轉導通路發(fā)揮直接作用，從而對細胞運動、分化和凋亡產生重要影響。ROS能夠誘導DC成熟，影響DC分泌促炎性細胞因子。DC內

7、含有像NADPH氧化酶那樣發(fā)揮作用所需的物質。當 DC與微生物成分或同源 T淋巴細胞相互作用時，DC產生ROS。因此，ROS可能作為DC的內源性調節(jié)體影響DC的功能發(fā)揮。
　　已有報道，ERK（extracellular regulated protein kinases）通路是MAPK通路中高度保守的通路，參與了多種細胞功能的發(fā)揮。ERK及其磷酸化的形態(tài)、ROS在SLE中表達異常，與疾病活動度相關，但現(xiàn)有的研究并未揭示單核細胞來

8、源的樹突狀細胞（monocytes-induced dendritic cells，moDC）中磷酸化的ERK（phosphorylation of ERK，pERK）、ROS表達是否異常，moDC分泌的炎癥性細胞因子是否異常，pERK的表達是否與ROS相關，炎癥性細胞因子的分泌是否與ROS相關，ROS會否經pERK通路影響炎癥性細胞因子的分泌。此外，本研究將探討moDC的抗原遞呈能力，以Th17細胞分化為例，推測其抗原遞呈能力是否改變

9、，且是否與ROS相關。這些研究將增進對moDC內ROS表達和（或）功能的了解。
　　第一部分 SLE患者外周血單核細胞來源的樹突狀細胞內ROS表達研究
　　目的：
　　從人外周血中提取出單核細胞誘導成樹突狀細胞后，比較SLE患者（新發(fā)病例，病情穩(wěn)定期病例）和正常對照的樹突狀細胞內 ROS表達水平差異，以探索 ROS與SLE之間的關聯(lián)。
　　方法：
　　在獲取研究對象知情同意后采用自行設計的問卷進行調查，同時

10、抽取15ml抗凝外周靜脈血，經淋巴細胞分離液分選出外周血單個核細胞，通過磁珠分選的方法提取出單核細胞，經完全培養(yǎng)基和誘導劑（rhGM-CSF+rhIL-4）培養(yǎng)7天，測定moDC內ROS表達水平：收集SLE病例20例（新發(fā)病例11例，病情穩(wěn)定期病例9例），健康對照20例；病例和對照組各分為LPS刺激組和未刺激組?；驈娜送庵苎蟹蛛x出單核細胞后，經含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，測定moDC內ROS表達水平：收集SLE病例10例（新發(fā)病例5

11、例，病情穩(wěn)定期病例5例），健康對照10例；病例和對照組各分為LPS刺激組和未刺激組。采用SPSS10.01軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。病例與對照數(shù)據進行比較時，符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗，不符合正態(tài)分布者采用Man-Whitney U檢驗。以P<0.05作為統(tǒng)計學差異的標準。
　　結果：
　?。?）經完全培養(yǎng)基和誘導劑（rhGM-CSF+rhIL-4）培養(yǎng)moDC時：20例SLE病例均為女性；20例健康對照中，女性19例、

12、男性1例。病例組平均年齡為32.0±7.9歲（年齡分布從20到44歲）；健康對照組平均年齡為34.1±12.8歲（年齡分布從22到59歲）。
　?、俳】祵φ张c病情穩(wěn)定期病例做比較時，moDC未經LPS刺激，ROS表達水平在兩者間比較的P=0.402；moDC經LPS刺激時，P=0.566。
　?、诮】祵φ张c新發(fā)病例做比較時，moDC未經LPS刺激，ROS表達水平在兩者間比較的P=0.358；moDC經LPS刺激時，P=0.6

13、70。
　?、鄄豢紤]疾病活動度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體，與健康對照做比較時，moDC未經LPS刺激，ROS表達水平在兩者間比較的P=0.194；moDC經LPS刺激時，P=0.646。
　?、芸紤]LPS刺激前后對健康對照或SLE病例自身moDC的影響：健康對照未經LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例未經LPS刺激的ROS表達水平，與健康對照經LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例經LPS刺激的ROS表達

14、水平做比較，即健康對照與病情穩(wěn)定期病例經刺激前后的比值間的比較，P=0.441；健康對照未經LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例未經LPS刺激的ROS表達水平，與健康對照經LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例經LPS刺激的ROS表達水平做比較，即健康對照與新發(fā)病例經刺激前后的比值間的比較，P=0.075。不考慮疾病活動度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體：健康對照未經LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例未經LPS刺激的ROS表達水平

15、，與健康對照經LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例經LPS刺激的ROS表達水平做比較，即所有健康對照與所有SLE病例經刺激前后的比值間的比較，P=0.062。
　?。?）經含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)moDC時：10對SLE病例和健康對照中，女性均為9例、男性各1例。病例組平均年齡為33.3±9.1歲（年齡分布從20到48歲）；健康對照組平均年齡為32.7±8.9歲（年齡分布從23到48歲）。
　?、俳】祵φ张c病情穩(wěn)定期病例做

16、比較時，moDC未經LPS刺激，ROS表達水平在兩者間比較的P=0.064；moDC經LPS刺激時，P=0.834。
　?、诮】祵φ张c新發(fā)病例做比較時，moDC未經LPS刺激，ROS表達水平在兩者間比較的P=0.530；moDC經LPS刺激時，P=0.292。
　?、鄄豢紤]疾病活動度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體，與健康對照做比較時，moDC未經LPS刺激，ROS表達水平在兩者間比較的P=0.791；moDC經LPS刺

17、激時，P=0.496。
　　④考慮LPS刺激前后對健康對照或SLE病例自身moDC的影響：健康對照未經LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例未經LPS刺激的ROS表達水平，與健康對照經LPS刺激的ROS表達水平/病情穩(wěn)定期病例經LPS刺激的ROS表達水平做比較，即健康對照與病情穩(wěn)定期病例經刺激前后的比值間的比較，P=0.447；健康對照未經LPS刺激的ROS表達水平/新發(fā)病例未經LPS刺激的ROS表達水平，與健康對照經LPS刺

18、激的ROS表達水平/新發(fā)病例經LPS刺激的ROS表達水平做比較，即健康對照與新發(fā)病例經刺激前后的比值間的比較，P=0.293。不考慮疾病活動度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體：健康對照未經LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例未經LPS刺激的ROS表達水平，與健康對照經LPS刺激的ROS表達水平/SLE病例經LPS刺激的ROS表達水平做比較，即所有健康對照與所有SLE病例經刺激前后的比值間的比較，P=0.821。
　　結論：<

19、br>　　本研究表明：SLE病例與健康對照外周血單核細胞來源的樹突狀細胞，其ROS表達水平在兩組間無顯著性差異。
　　第二部分 ROS與樹突狀細胞炎癥性細胞因子分泌的關聯(lián)研究
　　目的：
　　比較SLE患者（新發(fā)病例）和正常對照的樹突狀細胞內pERK表達水平及分泌的炎癥性細胞因子差異。分析ROS與pERK及炎癥性細胞因子間的關聯(lián)。
　　方法：
　　經完全培養(yǎng)基和誘導劑（rhGM-CSF+rhIL-4）、含S

20、LE血清的培養(yǎng)基兩種方法培養(yǎng)新發(fā)病例與健康對照的moDC時（前者為11對，后者為5對），收集上清液，-80℃凍存留待檢驗。采用ELISA試劑盒檢測上清液中與Th1，Th2，Th17相關的炎癥性細胞因子 IL-2，IL-6，IL-10，IL-17的表達水平。新發(fā)病例和健康對照各分為LPS刺激組和未刺激組。此外，收集經完全培養(yǎng)基和誘導劑（rhGM-CSF+rhIL-4）培養(yǎng)的新發(fā)病例與健康對照的moDC（11對，未經LPS刺激），裂解細胞，

21、經蛋白質印跡法（Western blot）檢測病例組與對照組間pERK表達水平。分析ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、pERK表達水平之間的關聯(lián)。本研究所采用的病例組、對照組細胞來自于第一部分培養(yǎng)的細胞。數(shù)據的分析采用SPSS10.01軟件進行，以α=0.05為檢驗水準。
　　結果：
　?。?）兩種方法培養(yǎng)moDC時，新發(fā)病例與健康對照的moDC，無論經LPS刺激還是未刺激，IL-2、IL-6、IL-10、IL-17的

22、表達水平在二者間均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。（2）經完全培養(yǎng)基和誘導劑培養(yǎng)moDC時，新發(fā)病例組與健康對照組的moDC未經LPS刺激，pERK表達水平在病例組中明顯低于健康對照組（P=0.031）。
　?。?）ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、pERK表達水平間均無顯著性關聯(lián)（P>0.05）；此外，pERK表達水平與炎癥性細胞因子表達水平間無統(tǒng)計學關聯(lián)（P>0.05）。
　　結論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)：與Th1，

23、Th2，Th17相關的炎癥性細胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-17在新發(fā)病例與健康對照間無統(tǒng)計學差異，但 pERK表達水平在新發(fā)病例組中明顯低于健康對照。然而炎癥性細胞因子（IL-2、IL-6、IL-10、IL-17）的分泌可能與ROS無關聯(lián)。
　　第三部分 ROS與樹突狀細胞抗原遞呈能力關聯(lián)探討，以Th17分化為例
　　目的：
　　將新發(fā)病例與健康對照的單核細胞培養(yǎng)成樹突狀細胞（moDC），然后分別與健康

24、對照的CD4+T細胞進行共培養(yǎng)，以探討moDC的抗原遞呈能力，以Th17分化為例。分析ROS表達水平與Th17分化間的關系，以推測moDC抗原遞呈能力的改變是否與ROS相關。
　　方法：
　　新發(fā)病例和健康對照的單核細胞經含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天（新發(fā)病例和健康對照各5例）；獲moDC后，分為不同的濃度組，再與健康對照（同一人）的T細胞（濃度恒定）進行共培養(yǎng)6天，然后用ELISA法檢測上清液中與Th17分化相關的炎癥性細

25、胞因子TGF-β、IL-6的表達水平；流式細胞儀檢測Th17細胞的表達水平在二者間的差異。分析 ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、Th17細胞表達水平的關聯(lián)。本研究所采用的病例組、對照組細胞來自于第一部分培養(yǎng)的細胞。數(shù)據的分析采用SPSS10.01軟件進行，以α=0.05為檢驗水準。
　　結果：
　　（1）新發(fā)病例、健康對照的 moDC，分別與同一健康對照的 CD4+T細胞共培養(yǎng)后，TGF-β、IL-6的表達水平在二者

26、間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　?。?）新發(fā)病例、健康對照的 moDC，分別與同一健康對照的 CD4+T細胞共培養(yǎng)后，Th17細胞的表達水平在二者間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　?。?）ROS表達水平與炎癥性細胞因子表達水平、Th17細胞表達水平間均無顯著性關聯(lián)（P>0.05）。
　　結論：
　　本研究表明：moDC的抗原遞呈能力在病例組與健康對照組間無顯著性差異（以Th17研究為例），moDC抗原遞呈能