桿狀病毒AcMNPV orf—51基因功能研究.pdf

1、AcMNPVorf-51基因是1994年MarinD等對AcMNPV基因組全序列進行分析預測的156個ORF中的一個。該基因由957個核苷酸組成，編碼含318個氨基酸殘基的大小為37KDa的蛋白質，多年以來，未見有文獻報道其功能。 以ORF-51蛋白的氨基酸序列對GenBankBLAST結果表明，ORF-51蛋白內部有一個保守的RNA結合motif,預測其為RNA結合蛋白，主要與RNA的轉錄、修飾相關，但功能還有待試驗證實。

2、 本論文綜合利用Bac-to-Bac和ET-Recombination的策略，通過基因敲除等方法研究orf-51基因在桿狀病毒中的生物學功能。首先，通過PCR方法擴增orf-51基因的上下游序列，再經過克隆將抗性基因連入orf-51基因的上下游序列之間構成敲除orf-51基因的線形DNA同源片段。隨后將此線形DNA同源片段電轉入含AcBacmid-PG的E.coli菌株，通過ET-Recombination技術發(fā)生同源重組，最后在含

3、ZeocinTM的低鹽LB平板上篩選orf-51缺失Zeocin插入的重組BacmidpAcKO。提取pAcKODNA，將其轉染sf-9昆蟲細胞，以研究orf-51的缺失對AcMNPV復制的影響。用可在熒光顯微鏡下觀察的gfp基因及可在光學顯微鏡下觀察的polyhedrin基因作為雙標記基因，GFP用以指示BV的產生及在離體細胞中的傳播，POLH則用來指示重組病毒在離體細胞中感染的進程。因此，構建了兩個帶雙標記基因的重組Bacmid：o

4、rf-51敲除型pAcKO-GP和orf-51野生型pAcwt-GP。將pAcKO-GP和pAcwt-GP的病毒DNA分別轉染Sf9細胞，由GFP的傳播狀態(tài)可直接觀察這兩種重組病毒在復制能力方面有無差別。試驗結果表明，pAcKo-Gp和pAcWt-GP均能產生BV和形成多角體，轉染上清的感染試驗進一步證實，orf-51的缺失對病毒產生BV的能力沒有影響。在光學顯微鏡下觀察到orf-51的缺失對病毒ODV的產生沒有影響。生物學測定結果顯示