題目一：EBV基因LMP1及BARF1在鼻咽上皮細胞惡性轉化中的作用;題目二：Bmi-1及Mel-18在乳腺癌組織中的表達相關性及意義.pdf

1、鼻咽癌是極具地方特色的惡性腫瘤，中國華南地區(qū)尤其是廣東省是鼻咽癌發(fā)病率最高的區(qū)域，是世界低發(fā)地區(qū)的數(shù)十倍。鼻咽癌的發(fā)病原因至今還不十分清楚，普遍認為與遺傳，環(huán)境，EBV感染等因素有關。鼻咽癌發(fā)病過程包括正常-輕度異型增生/化生-重度異型增生/化生-原位癌-浸潤性轉移癌等步驟，此外，鼻咽癌也是惡性程度較高的腫瘤，甲．期即可發(fā)牛頸部淋巴結轉移。因此如果對鼻咽癌的研究有突破，將可能為整個腫瘤病因學及發(fā)牛發(fā)展機制的研究提供一個具有典型意義的模型

2、。我們實驗室已建立了首個原本實驗擬用人端粒酶催化亞單位誘導鼻咽上皮永生化，以便建立攜帶癌前病變分子特征的細胞株，對于闡明鼻咽癌早期發(fā)生的分子事件具有重要意義，然后在永生化鼻咽上皮的基礎上建立穩(wěn)定表達LMP1，BARF1的細胞，研究其惡性轉化功能。 研究目的： 建立能反映鼻咽癌癌變過程中不同時期的模型，為進一步闡明鼻咽癌的發(fā)病機制提供信息。 實驗方法： 收集非鼻咽癌活檢組織(男性)，原代培養(yǎng)，建立正常鼻咽上

3、皮細胞，用hTERT誘導鼻咽上皮細胞永生化。在永生化鼻咽上皮細胞的基礎上建立穩(wěn)定表達LMP1和BARF1的細胞，并且檢測它們能否惡性轉化鼻咽上皮細胞。 1．細胞培養(yǎng)：建立永生化的鼻咽上皮細胞及穩(wěn)定表達EBV基因LMP1，BARF1的鼻咽上皮細胞2．Western B10tting：在翻譯水平檢測各蛋白的表達3．端粒酶活性測定：判斷細胞永生化的標志性實驗之一4．端粒長度測定：判斷細胞永生化的標志性實驗之一5．倍增曲線分析：分析細胞

4、倍增速率，倍增倍數(shù)6．三維培養(yǎng)：模擬體內環(huán)境下的生長方式并分析形態(tài)差異7．侵襲實驗：比較幾種細胞在侵襲功能上的差異8．生長因子依賴性實驗：比較幾種細胞對生長因子的依賴性9．染色體核型分析：判斷細胞是否有染色體核型改變10．軟瓊脂集落形成實驗：比較幾種細胞錨定非依賴性生長方式及集落形成能力實驗。 結果： 1．建立了N5-hTERT永生化的鼻咽上皮細胞N5-hTERT細胞形態(tài)變小，變圓，有很多小細胞長出，折光增強，很有活力。

5、但不形成重疊生長。而N5-pBABE細胞扁平多角形，貼壁生長，細胞間形態(tài)，大小不一致，在光鏡下細胞活力不強，存在接觸抑制，未見重疊生長。大約7天左右傳代一次，細胞傳到第7代左右時，細胞就開始出現(xiàn)衰老死亡，細胞體積變大，形態(tài)不規(guī)則。端粒酶活性結果顯示，通過外源性hTERT表達誘使細胞恢復端粒酶活性，細胞端粒和增值活性保持穩(wěn)定， N5-hTERT的端粒酶活性隨著細胞的永生化顯著增強。端粒長度比N5明顯縮短，但從第10代開始維持穩(wěn)定。倍增曲線

6、結果顯示N5-hTERT比N5-PBABE生命復制周期明顯延長，倍增倍數(shù)顯著增加，倍增到80CPD左右。。N5-hTERT在三維培養(yǎng)中主要出現(xiàn)網狀結構，與N5在三維培養(yǎng)的形態(tài)相近。染色體顯示N5-hTERT-P5染色體依然表現(xiàn)為正常男性染色體， N5-hTERT-P11 染色體為 47，XY，+der(22)t(22；?)，der(?)t(22；?)。22號染色體出現(xiàn)異常。N5-hTERT在軟瓊脂實驗中未見克隆形成，而軟瓊脂實驗是檢測體

7、外惡性轉化的重要實驗之一，N5-hTERT無惡變傾向。侵襲實驗結果顯示N5-hTERT不能穿出Transwell小室，我們認為N5-hTERT并無惡性轉化功能。 2．建立了穩(wěn)定表達LMP1及BARF1的鼻咽上皮細胞； 3．LMP1對N5-hTERT的惡性轉化作用三維培養(yǎng)結果顯示N5-hTERT-LMP1形成形態(tài)不規(guī)則的大克隆，細胞連接松散，有很多偽足伸出，有向外擴張的趨勢。N5-hTERT-LMP1可導致細胞出現(xiàn)多倍體，

8、出現(xiàn)多條染色體的易位，缺失，甚至出現(xiàn)四倍體，腫瘤細胞核型，在Transwell實驗中，細胞穿出能力比N5-hTERT顯著增強，且具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。在完全培養(yǎng)基中，N5-hTFRT-LMP1與N5-hTERT無顯著差別。但是在10﹪EGF，BPE的培養(yǎng)基中，從第5天開始N5-hTERT-LMP1比N5-hTERT的牛長明顯增快(P=0.000)，在無生長因子的培養(yǎng)基中，從第3天開始N5-hTERT-LMP1比N5-hTER

9、T的牛長明顯增快(P=0.001)，表明N5-hTERT-LMP1對生長因子的依賴性降低，具有惡變傾向。 4．BARF1對N5-hTERT的惡性轉化作用三維培養(yǎng)結果顯示N5-hTERT-BARG1形成邊緣光滑的大克隆，無偽足伸出。但是BARF1不能引起染色體核型變化。在細胞侵襲性實驗中，N5-hTERT-BARF1的細胞能夠穿出Transwell小室，與N5-hTERT差異顯著(P=0.000)。在生長因子依賴性實驗中，N5-h

10、TERT-BARF1與N5-hTERT無顯著差別，但是在10﹪EGF，BPE的培養(yǎng)基中，從第5天開始N5-hTERT-BARF1比N5-hTERT的生長明顯增快(P=0.000)，在無生長因子的培養(yǎng)基中，從第3天開始N5-hTERT-BARF1比N5-hTERT的牛長明顯增快(P=0.013)，表明N5-hTERT-BARF1對生長因子的依賴性降低，具有惡變傾向。 實驗結論： 1．由單基因hTERT誘使鼻咽上皮細胞永?；?/p>

11、的細胞，但無惡性轉化的功能。關于hTERT永生化的鼻咽上皮細胞國內外至今尚未見報道。為我們實驗室在建立永生化鼻咽上皮細胞的方面進一步積累了寶貴經驗。 2．在N5-hTERT永?；谋茄噬掀ぜ毎幕A上，建立了穩(wěn)定表達LMP1的鼻咽上皮細胞，這對于研究鼻咽癌的惡變機制具有重要意義。 3．在N5-hTERT永生化的鼻咽上皮細胞的基礎上，建立了穩(wěn)定表達BARF1的鼻咽上皮細胞，體外實驗證實BARF1能使永生化的鼻咽上皮細胞惡性

12、轉化，這是第一次證實BARF1能使鼻咽上皮細胞惡性轉化，為進一步研究EBV的致病機制提供了前景。 本實驗的研究目的就是探索Mel-18在乳腺癌組織的表達情況，研究其與臨床資料間的關系，并分析其預后意義。 研究目的： 揭示Mel-18在乳腺癌的表達情況，探討Mel-18與臨床病理特征的關系，分析其與預后的關系，為乳腺癌的預防，診治，篩查，預后提供新的信息。 實驗方法： 收集137例乳腺癌組織及30例

13、癌旁組織， 137例癌組織中，有75例標本來源于2002年以前的標木，62例來源于2004-2005年的標本，30例癌旁組織也來源于2002年以前的標木。用免疫組織化學方法對這些組織進行Mel-18與Bmi-1的檢測，統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理。 實驗結果： 54(37.9﹪)例癌組織顯示Mel-18陽性，88(64.2﹪)例癌組織顯示Bmi-1陽性，5(3.6﹪)例顯示兩者均陽性。26(86.7﹪)例癌旁

14、組織顯示Mel-18陽性，儀儀13(43.3﹪)例癌旁組織顯示Bmi-1陽性，9(30﹪)例癌旁組織兩者均陽性。103(75.2﹪)例顯示核陽性，34(24.8﹪)例顯示漿陽性。而且Bmi-1在癌巢邊緣表達高，Mel-18在正常導管組織，癌旁組織比癌組織表達高。統(tǒng)計結果提示，無論在癌旁組織(p=0.000)還是在癌組織(p=0.013)Mel-18與Bmi-1表達負相關。而且Mel-18也與T分期(p=0.001)，淋巴結轉移(p=0.

15、002)，臨床分期(p=0.000)，ER(p=0.005)相關。Bmi-1與T分期(p=0.025)，淋巴結轉移(p=0.001)，臨床分期(p=0.000)，ER(p=0.024)， PR(p=0.046)相關。多因素分析結果提示聯(lián)合檢測Mel-18和Bmi-1對乳腺癌的的預防，診治，篩查，預后有意義(p=0.027)。生存曲線顯示乳腺癌組織高表達Mel-18，病人預后較好，五年牛存率也較高。高表達Bmi-l的病人預后差。