竹葉青蛇毒磷酸二酯酶的研究.pdf

1、磷酸二酯酶(PDEs)是一個超級酶家族，在細(xì)胞外核苷酸代謝和調(diào)節(jié)以核苷酸為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)信號等功能中有多重作用。PDEs影響多個途徑的生理學(xué)過程，包括早期炎癥介質(zhì)的生成及發(fā)展，離子通道，肌肉收縮，脂肪生成，肝糖生成和糖質(zhì)分解等。PDEs廣泛存在于蛇毒中，一般都是大分子量（>90kDa），單個多肽鏈的蛋白。PDEs有廣泛的底物特異性，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，煙酰胺鳥嘌呤二核苷酸(NGD)，ATP，ADP等生物體內(nèi)重要的核苷酸，都能被

2、它水解。雖然有些 PDEs已經(jīng)從蛇毒中被分離出來，但是它們的氨基酸或者全長cDNA序列到現(xiàn)在都沒有可參考的信息。到目前為止，竹葉青蛇毒中還沒有分離純化出PDE，鑒于PDEs多重的生理學(xué)功能，因此希望能從竹葉青蛇毒中分離出一種新型的PDE。本文主要講述了竹葉青蛇毒中PDE的分離純化,結(jié)構(gòu)和酶活性。
　　 第一章：概述了PDEs的研究進(jìn)展，以及常用的研究蛋白質(zhì)的實驗手段。通過這一章可以對PDEs的生物學(xué)功能,分類，組織分布及晶體結(jié)構(gòu)

3、有全面的了解。文中同時也介紹了蛇毒中的PDEs的結(jié)構(gòu)和酶活性。其次對研究蛋白質(zhì)的幾種常用手段做了總結(jié)，包括紫外光譜、熒光光譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)測序。
　　 第二章：文中首次介紹了通過離子交換色譜和凝膠過濾色譜從竹葉青蛇毒中提純出磷酸二酯酶（TS-PDE）的方法。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測定了TS-PDE的分子量為100KD，并且是由二硫鍵連接的二聚體組成。通過毛細(xì)管等電聚焦電泳，測定出TS-P

4、DE的等電點為5.1。另外，上述的兩種檢測方法也說明了TS-PDE是一種單一的蛋白質(zhì)。通過Edman降解法對蛋白質(zhì)N端序列進(jìn)行了分析，TS-PDE的四個N端序列分別為：纈氨酸/絲氨酸，谷氨酰胺/亮氨酸，丙氨酸/酪氨酸,天冬氨酸/亮氨酸。由于兩條鏈的N端氨基酸序列不同，因此TS-PDE是由二硫鍵連接的異型二聚體，與其它已知PDEs結(jié)構(gòu)有所不同。另外,也測定了TS-PDE的糖含量。
　　 第三章：在本章中主要研究了TS-PDE的酶活

5、性及其對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用。實驗中主要利用HPLC的方法，以NAD,NGD,ATP，ADP為底物，詳細(xì)的闡述了TS-PDE的酶活性并測定了各個底物的酶動力學(xué)參數(shù)。PDEs有廣泛的底物特異性，NAD,NGD，ATP，ADP均可被TS-PDE催化水解。在蛇毒中分離純化PDE的過程中，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是純化的PDE中含有5'-核苷酸酶和堿性磷酸酶的雜質(zhì)。為了驗證TS-PDE的純度，分別以AMP和對-苯硝基磷酸鹽為底物進(jìn)行測定，結(jié)果

6、在實驗過程中均未發(fā)現(xiàn)有5'-核苷酸酶和堿性磷酸酶活性，這進(jìn)一步證明了竹葉青蛇毒中純化分離的TS-PDE是一種單一的酶。TS-PDE是從DNA的3'端開始逐一水解磷酸二酯鍵，釋放5'-磷酸單核苷酸的，所以它可作為一種工具應(yīng)用于寡聚和多聚核苷酸氨基酸序列的測定。我們同時測定了TS-PDE對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，實驗證明TS-PDE能夠明顯的抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，因此，它可能成為一種潛在的抗血栓藥物。
　　 第四章：本章

7、主要研究了金屬離子和鏈間二硫鍵對TS-PDE酶活性和結(jié)構(gòu)的影響。利用離子體發(fā)射光譜儀和質(zhì)譜儀，測定TS-PDE結(jié)構(gòu)中有Cu2+和 Zn2+的存在。據(jù)所知，TS-PDE是唯一一個含有Cu2+的磷酸二酯酶。金屬螯合物EDTA基本上能夠完全抑制TS-PDE的酶活性，說明金屬離子的存在對TS-PDE的酶活性是必需的。在去金屬離子的TS-PDE（apo-TS-PDE）中加入Cu2+和 Zn2+，對酶活性都有一定的恢復(fù)作用,說明TS-PDE的活性依