家豬骨髓基質(zhì)細胞的多向分化與透明質(zhì)酸成骨作用的實驗研究.pdf

1、長期以來，自體骨移植一直是骨的修復與重建方法的金標準。由于自體骨移植存在許多不足，如取材有限、失血、延長手術時間、疤痕形成、增加病人痛苦等，因此，尋找安全有效的替代自體骨移植的方法成為世界性研究熱點。近年來，隨著材料科學的進展，骨組織工程技術得到了迅速發(fā)展。然而，基于支架材料的骨組織工程技術所遇到的一些基本問題尚未完全解決，阻礙了該技術在臨床上的廣泛應用。這些基本問題包括：種子細胞的來源、種子細胞的擴增與分化調(diào)控、以及支架材料的選擇等問

2、題。 骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)是骨髓中的一類非造血干細胞，它不僅具有支持和調(diào)節(jié)骨髓造血的功能，而且在適宜的條件下可向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等分化，并且能在體外自我更新，成為理想的組織工程種子細胞。 迄今為止，已從人、大鼠、小鼠、雞、牛、狗、豬等骨髓中分離出BMSC。自從Friedenstein等(1976)首次利用貼塑料壁的特點從成體骨髓中分離出具有成骨潛能的BMSC以來，人們對其分化特性及其機制進行了大量的研究。

3、BMSC分化調(diào)控通路受多種細胞因子、激素、物理作用等復雜因素的影響。這些因素在轉(zhuǎn)錄因子水平通過調(diào)控各自分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，從而最終決定細胞分化方向。骨髓基質(zhì)細胞成骨分化的一般特點是成骨細胞形態(tài)的形成、堿性磷酸酶(ALP)活性的增加以及包含I型膠原(C011)、骨涎蛋白(BSP)、骨連接素(ON)和骨鈣素(OC)等骨基質(zhì)蛋白的骨樣礦化形成。核心結(jié)合因子a1(cbfal)和位于cbfal的下游的osterix被認為是骨髓基質(zhì)細胞成骨分化的

4、最關鍵轉(zhuǎn)錄因子。 目前，以家豬BMSC作為組織工程種子細胞的研究日益增多，家豬BMSC被認為是較為理想的組織工程種子細胞模型，但其多向分化研究報道不多。在體外誘導其BMSC的成骨、成軟骨和成脂肪分化，調(diào)查其各向分化相關基因的表達及其相互關系將為進一步以家豬BMSC作為細胞模型進行組織工程的相關基礎研究打下基礎。 另一方面，在構(gòu)建組織工程骨時，支架材料對于骨與關節(jié)組織修復與重建十分重要。三維多孔金屬鉭支架材料由于良好的機械

5、強度以及多孔的特點，在臨床上用作非骨水泥型人工關節(jié)的骨接觸面已有10余年的歷史，近年來也用于制作脊柱融合器。然而，與其它多孔材料一樣，單純將多孔金屬鉭植入病人體內(nèi)，僅通過周圍組織的長入來達到生物學固定，難以實現(xiàn)有目的、可控制的組織再生，達不到與周圍骨組織愈合的預期效果。因此，需要同時在支架材料內(nèi)或者周圍結(jié)合自體骨、異體骨、生長因子或具有多分化潛能的BMSC，發(fā)揮支架材料的骨傳導作用與其他生物學因子的骨誘導作用，從而達到骨的修復重建的目的

6、。動物實驗與臨床研究報道了多種生物材料復合重組人類骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)在脊柱融合方面成功的結(jié)果。但rhBMP-2價格昂貴，臨床上難以廣泛推廣。牛Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石／磷酸三鈣的復合物(Collagraft)作為組織工程骨支架材料有較大的潛力，但這種類型材料缺乏機械強度，其臨床應用受到一定的限制。 透明質(zhì)酸(HA)是細胞外基質(zhì)(ECM)重要的組成成分，廣泛分布于機體各種組織之中，在長骨，它占總粘多糖(GAG)的

7、3％。它不僅是結(jié)構(gòu)成分，而且通過結(jié)合細胞表面受體，在生理和病理修復過程中參與細胞的遷移、增殖、聚集和分化。最近研究報道，低分子量透明質(zhì)酸能促進小鼠顱骨成骨細胞的體外成骨。高分子量透明質(zhì)酸能加速小鼠骨創(chuàng)面的愈合。高分子量透明質(zhì)酸處理大鼠顱骨成骨細胞48小時能促進細胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性的表達及上調(diào)骨鈣素。透明質(zhì)酸可明顯刺激家豬BMSC增殖，早期誘導堿性磷酸酶分泌及上調(diào)骨鈣素基因表達水平。 本論文以家豬BMSC為研究對象，

8、著重探討其體外多向分化機制和透明質(zhì)酸對其成骨分化的影響；以家豬前路椎體間融合模型為實驗動物模型，建立術中分離BMSC技術，將BMSC與透明質(zhì)酸水凝膠復合接種于多孔金屬鉭脊柱融合器后，立即植入家豬椎體間隙。在骨環(huán)境中，利用透明質(zhì)酸對BMSC體內(nèi)擴增與成骨分化作用，促進脊柱融合的愈合。并與Collagraft復合BMSC或rhBMP-2相比較，以期發(fā)展是一種新穎的、經(jīng)濟的、簡單易行的、有效的自體骨替代物。論文共分3部分： 第一部分

9、 家豬骨髓基質(zhì)細胞成骨、成軟骨與成脂肪分化相關基因表達的分析 1方法 1.1 BMSC分離 1.2 BMSC分化 1、3數(shù)據(jù)處理數(shù) 2結(jié)果 2．1家豬BMSC特征 培養(yǎng)第1天，有核細胞大部分由懸浮的圓形血源性細胞組成。第3天換液棄除這些非貼壁細胞，BMSC克隆開始形成，細胞呈成纖維細胞樣生長。第7天，在顯微鏡下觀察到大小不一的克隆。BMSC占有核細胞的0.002-0.01

10、％。細胞在12到14天基本長滿。我們觀察到細胞傳代到10代仍保持成纖維細胞樣生長和增殖能力。原代細胞群體倍增值(PDs)平均為13，傳代倍增次數(shù)平均為2.8。 2．2家豬BMSC成骨分化 2．2．1 BMSC形態(tài)學與組織學觀察 2．2．3BMSC成骨分化相關基因的表達 2．3 BMSC成脂肪分化 2．4 BMSC成軟骨分化 3 結(jié)論 3．1密度梯度離心法從骨髓分離的家豬BMSC

11、具有多向分化潛能，體外能向成骨、成脂肪和成軟骨分化。 3．2家豬BMSC向某個方向分化的潛能有賴于該向分化特異基因的上調(diào)和其它方向分化基因的抑制。 第二部分 透明質(zhì)酸對家豬骨髓基質(zhì)細胞體外成骨分化的影響 1方法 1.1 BMSC的分離 方法同第一部分所述。 1.2 BMSC培養(yǎng) 第一代細胞長滿消化后，6000 cells/cm<'2>的BMSC分別種植在普通培養(yǎng)液和含4.0 mg

12、/ml 800 kDa透明質(zhì)酸的普通培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7天。之后，經(jīng)透明質(zhì)酸預處理的BMSC消化后，分別種植在普通培養(yǎng)液、含透明質(zhì)酸的普通培養(yǎng)液、成骨誘導培養(yǎng)液和含透明質(zhì)酸的成骨誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)。未經(jīng)透明質(zhì)酸預處理的BMSC分別種植在普通培養(yǎng)液和成骨誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分別在第7、14、21天收集細胞，進行基因表達分析，于第21天進行鈣沉積檢測。 1.3.透明質(zhì)酸對BMSC增殖的影響 1000cells/cm<'2>的BMSC

13、分別種植在上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天。SYBR green I檢測細胞數(shù)。 1.4.數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(-x±S)表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0(Chicago，IL)進行統(tǒng)計分析。細胞增殖和鈣沉積用單因素方差分析(One-way ANOVA)?；虮磉_結(jié)果用兩因素方差分析(Two-way ANOVA)，當各因素的主效應或主效應之間的交互效應有統(tǒng)計意義時，采用配對t檢驗進行組間比較。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

14、 2結(jié)果 2.1透明質(zhì)酸對BMSC增殖的影響 2.2透明質(zhì)酸對BMSC礦化的影響 2.3透明質(zhì)酸對細胞內(nèi)透明質(zhì)酸合成酶2(has2)的影響 2.4透明質(zhì)酸對BMSC成骨相關基因基礎表達水平的影響 2.5透明質(zhì)酸對BMSC成骨相關基因表達與作用時間的關系 3結(jié)論 透明質(zhì)酸對BMSC成骨分化的早期和后期均有重要作用。在早期，透明質(zhì)酸主要促進BMSC增殖；在中晚期，

15、在成骨條件下，透明質(zhì)酸可增強BMSC成骨分化。 第三部分 透明質(zhì)酸復合自體骨髓基質(zhì)細胞在家豬脊柱融合模型中的作用 1方法 1.1骨髓的抽取和分離 術前脛骨近端抽取骨髓，F(xiàn)icoll-Paque Plus分離，細胞記數(shù)，具體方法同 第一部分所述。 1．2多孔金屬鉭椎間融合器和圓盤的準備 1.3細胞、透明質(zhì)酸與多孔金屬鉭圓盤的體外培養(yǎng) 1.4數(shù)據(jù)處理 2結(jié)

16、果 2.1細胞、透明質(zhì)酸與多孔金屬鉭圓盤的體外培養(yǎng)結(jié)果 體外培養(yǎng)24小時和7天的細胞數(shù)分另lJ為98955.3±14456.3和92462.8±17456.0，兩者無顯著差異(P~-0.05)?；睿兰毎旧Y(jié)果證實，活細胞不僅存在于24小時培養(yǎng)的多孔鉭圓盤表面，而且存在于7天培養(yǎng)的多孔鉭圓盤內(nèi)部。 2.2組織學觀察 組織學觀察表明：與Collagraft復合BMSC或rhBMP-2組兩個對

17、照組相比較，透明質(zhì)酸復合BMSC在多孔金屬鉭融合器中央孔中形成的小梁骨形態(tài)學上更為成熟，Collagrat~組仍殘留有羥基磷灰石／磷酸三鈣。多孔金屬鉭材料小孔內(nèi)以及椎體相鄰區(qū)域的骨組織沒有明顯區(qū)別。 2.3骨組織形態(tài)計量學檢測結(jié)果 在透明質(zhì)酸復合細胞組、Collagratt復合細胞或rhBMP-2組中，多孔金屬鉭材料小孔中，所形成的新骨骨量分別為19.8％、1 8.5％、20.2％。在上述各組多孔金屬鉭脊柱融合器的中央