SLIT2在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)控.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是婦科常見(jiàn)的良性疾病之一,在生育期婦女中發(fā)病率為10-15％,因其臨床表現(xiàn)多變,僅依據(jù)其臨床表現(xiàn)往往不能確診,故EM的實(shí)際發(fā)病率甚至更高。EM以痛經(jīng)、不孕、性交痛等臨床癥狀為特征,嚴(yán)重影響了患病婦女的生活質(zhì)量。
　　EM的病因目前尚不清楚。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)可Sampson的種植學(xué)說(shuō)。根據(jù)此學(xué)說(shuō),異位病灶在形成和生長(zhǎng)過(guò)程中需要氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)。研究表明,新生血管生成是EM的重要特征。而

2、目前對(duì)EM新生血管生成的機(jī)理了解尚不透徹。
　　EM治療目前以手術(shù)和藥物治療為主,手術(shù)有較高的復(fù)發(fā)率,而藥物治療存在藥物副作用及停藥癥狀復(fù)現(xiàn)等問(wèn)題。由于EM對(duì)血管生成高度依賴(lài),近年來(lái)EM抗血管生成治療開(kāi)始得到關(guān)注。在抗血管生成治療的研究中,以VEGF-A為靶點(diǎn)的藥物研究得最多,但發(fā)現(xiàn)藥物遠(yuǎn)期療效不佳,提示血管生成可能通過(guò)其他途徑發(fā)生了代償。
　　近年來(lái)研究表明,多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)一種大分子蛋白SLIT2。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種大分子

3、蛋白能通過(guò)與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的ROBO1受體結(jié)合從而誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng),動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明該分子SLIT2能促進(jìn)腫瘤新生血管生成。由于子宮內(nèi)膜異位癥在生物學(xué)行為上類(lèi)似惡性腫瘤,且對(duì)血管生成高度依賴(lài),故SLIT2極有可能也在異位內(nèi)膜病灶表達(dá)。SLIT2的表達(dá)同時(shí)也可以解釋抗血管生成治療研究中的耐藥問(wèn)題,即在VEGF-A等已知途徑外尚存在其他血管生成機(jī)制,當(dāng)阻斷VEGF-A后,極有可能通過(guò)其他血管生成途徑發(fā)生了代償,從而藥物療效不佳。

4、前期研究用免疫組織化學(xué)的方法已證明SLIT在異位內(nèi)膜中表達(dá),與正常內(nèi)膜中的表達(dá)相比上調(diào),且其表達(dá)與微血管密度(MVD)密切相關(guān)。由于該免疫組化實(shí)驗(yàn)中用到的抗體同時(shí)結(jié)合三種SLIT亞型,故哪一種或幾種亞型在異位灶中表達(dá)尚不清楚。由于間質(zhì)細(xì)胞在異位病灶的黏附、生長(zhǎng)等過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,故本研究擬從細(xì)胞水平研究異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2及其受體ROBO1的表達(dá),并探討可能的調(diào)控因素及調(diào)控機(jī)理。
　　第一部分:SLIT2在人異位內(nèi)膜間

5、質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)。
　　目的:檢測(cè)原代培養(yǎng)的異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中是否存在SLIT2 mRNA表達(dá);若有表達(dá),相對(duì)于正常婦女子宮內(nèi)膜來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2 mRNA的表達(dá)水平有無(wú)區(qū)別;探討SLIT2 mRNA表達(dá)在月經(jīng)周期中是否波動(dòng)。
　　方法:用原代培養(yǎng)的方法獲得異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞;用RT-PCR方法檢測(cè)其中有無(wú)SLIT2 mRNA的表達(dá);用相對(duì)定量Real-time PCR方法觀察SLIT2 mRNA表達(dá)在

6、月經(jīng)周期中是否波動(dòng);用相對(duì)定量Real-time PCR方法比較SLIT2 mRNA在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的高低。
　　結(jié)果:在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和正常內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中存在SLIT2、SLIT3、ROBO1、ROBO2 mRNA的表達(dá),四者密切相關(guān);SLIT2 mRNA水平在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較高。SLIT2 mRNA表達(dá)在月經(jīng)周期中存在波動(dòng)。
　　結(jié)論:SLIT2 mRNA在異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)。<

7、br>　　第二部分:調(diào)控異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2表達(dá)的因素
　　目的:探討異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2表達(dá)的調(diào)控因素。
　　方法:用相對(duì)定量Real-time PCR方法檢測(cè)不同濃度或作用時(shí)間時(shí)雌激素、孕激素或TNF-a對(duì)SLIT2 mRNA表達(dá)的影響;用Western blot方法檢測(cè)10-7mol/L雌激素、0.1ng/ml TNF-a對(duì)SLIT2蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:SLIT2表達(dá)受雌激素與TNF-a調(diào)

8、控,雌激素與TNF-a調(diào)控SLIT2mRNA表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性,10-7mol/L17β-雌二醇與0.1ng/ml TNF-a顯著上調(diào)SLIT2 mRNA及蛋白水平。孕激素對(duì)SLIT2 mRNA調(diào)控不明顯。
　　結(jié)論:雌激素與TNF-a可調(diào)控異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SLIT2 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　目的:探討異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中雌激素調(diào)控SLIT2表達(dá)的機(jī)理。
　　方法:以雌激素受體拮抗劑ICI182780、PI3K/Akt

9、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑Aktinhibitor IV和LY294002、eNOs抑制劑L-NAME分別作用于異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,用Western blot方法觀察其是否抵消雌激素誘導(dǎo)的SLIT2蛋白表達(dá),以檢測(cè)雌激素上調(diào)SLIT2是否通過(guò)雌激素受體ER、PI3K/Akt信號(hào)通路及其下游的eNOs信號(hào)通路介導(dǎo);分別以Era和Erβ特異性激動(dòng)劑PPT和DNP作用于異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,用Western blot方法觀察SLIT2表達(dá)是否上調(diào),以檢測(cè)介

10、導(dǎo)雌激素上調(diào)SLIT2的ER受體亞型;以Akt過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,用Western blot方法觀察SLIT2表達(dá)是否上調(diào),以檢測(cè)Akt是否介導(dǎo)SLIT2表達(dá)。
　　結(jié)果:1μM ICI182780、l00nM Akt inhibitorⅣ、10μM LY294002、500μM L-NAME均明顯下調(diào)異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中本底的SLIT2、ROBO表達(dá)及10-7mol/L17β-雌二醇誘導(dǎo)的SLIT2、ROBO1表達(dá)。E