補陽還五湯抗腦缺血損傷及增強腦缺血耐受的作用和機制研究.pdf

1、目的通過動物實驗證實補陽還五湯(BuyanghuanwuTang，BYHWT)具有抗腦缺血損傷作用，并從抗氧化應激和調控凋亡相關基因蛋白表達等角度探討其作用機制。在此基礎上，建立小鼠腦缺血耐受(brainischemictolerance，BIT)模型，觀察BYHWT干預腦預缺血(cerebralischemicpreconditioning，CIP)誘導BIT形成的情況，以期證實BYHWT具有增強CIP腦保護效果，促進腦缺血耐受形成的

2、作用，并初步探討其作用機制，進一步為臨床使用BYHWT預防和治療腦缺血性疾病提供實驗依據(jù)。 方法第一部分補陽還五湯抗腦缺血損傷的作用和機制研究將48只健康昆明小鼠隨機分為三組：假手術組、缺血損傷組和中藥預防組，每組n=16。中藥預防組灌服補陽還五湯煎劑，每次10ml/kg(體重)，2次/日，連續(xù)7d；假手術組和缺血損傷組灌服等量生理鹽水。7d后缺血損傷組和中藥預防組均用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈20min，然后恢復灌流；假手術組只

3、暴露雙側頸總動脈20min，但不阻斷血流。術后24h從各組隨機選取8只小鼠斷頭處死，迅速剝取全腦，左側半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織SOD活性和MDA含量；右側半球用4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化方法檢測海馬組織Bax和bcl-2蛋白表達。其余小鼠于術后7d全部處死，迅速剝取全腦，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學分級和神經(jīng)元密度(neuronald

4、ensity，ND)，免疫組化檢測Bax和bcl-2蛋白同上。 第二部分補陽還五湯增強腦缺血耐受的作用和機制研究將64只健康昆明小鼠隨機分為四組：假手術組、缺血損傷組、BIT模型組和中藥干預組，每組n=16。中藥干預組灌服補陽還五湯煎劑，每次10ml/kg(體重)，2次/日，連續(xù)7d；假手術組、缺血損傷組和BIT模型組灌服等量生理鹽水。灌藥第5天中藥干預組和BIT模型組均用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈6min作為預處理，然后恢復灌流

5、；假手術組和缺血損傷組只暴露雙側頸總動脈6min，但不阻斷血流。灌藥第7天缺血損傷組、中藥干預組和BIT模型組均阻斷雙側頸總動脈血流20min，然后恢復灌流；假手術組只暴露頸總動脈20min，但不阻斷血流。末次手術后24h從各組隨機選取8只小鼠斷頭處死，迅速剝取全腦，左側半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織SOD活性和MDA含量。其余小鼠于末次手術后7d全部處死，迅速剝取全腦，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，

6、HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學分級和神經(jīng)元密度(ND)，免疫組化檢測Bax和bcl-2蛋白同上。 結果第一部分補陽還五湯抗腦缺血損傷的作用和機制研究1.術后7d海馬CA1區(qū)組織病理學改變光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術組海馬CA1區(qū)無明顯組織學損傷，組織學分級多為0級和1級。缺血損傷組海馬CA1區(qū)組織學損傷明顯，主要表現(xiàn)為錐體細胞缺失較多，殘留的錐體細胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)錐體細胞胞核固縮，組織學分級多為2級和3級，與假手術組相比有

7、顯著性差異(P＜0.05)。中藥預防組海馬CA1區(qū)組織學損傷輕微，組織學分級多為1級和0級，與假手術組相比無顯著性差異(P＞0.05)，而與缺血損傷組相比差異顯著(P＜0.05)。 通過計算海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度得知，假手術組(ND=212±27n/mm)和中藥預防組(ND=184±32n/mm)神經(jīng)元密度均明顯高于缺血損傷組(ND=73±36n/mm，P＜0.01)，而假手術組和中藥預防組無明顯差異(P＞0.05)。2.術后2

8、4h腦組織SOD活性和MDA含量變化 缺血損傷組小鼠腦組織SOD活性(175.82±36.97U/ml)與假手術組(372.78±29.82U/ml)相比明顯下降(P＜0.01)，而MDA含量(9.60±0.63nmol/ml)與假手術組(5.43±0.38nmol/ml)相比明顯升高(P＜0.01)。與缺血損傷組相比，中藥預防組SOD活性(352.16±28.35U/ml)明顯升高(P＜0.01)，而MDA含量(6.01±0.

9、40nmol/ml)明顯下降(P＜0.01)。 3.術后24h、7d海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達變化假手術組Bax可見微弱表達(24h：11.49±1.83。7d：11.59±1.93。單位：陽性細胞數(shù)/視野，下同)，bcl-2未見明顯表達(24h：5.12±1.37。7d：6.17±1.34)。與假手術組相比，缺血損傷組Bax表達(24h：48.70±3.52。7d：48.96±3.42)明顯增多(P＜0.01)，b

10、cl-2表達亦見增多(24h：6.26±1.46。7d：6.77±1.22)，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與缺血損傷組相比，中藥預防組Bax表達(24h：17.73±2.37。7d：18.52±2.50)明顯減少(P＜0.01)，bcl-2表達(24h：25.96±1.57。7d：27.23±1.41)明顯增多(P＜0.01)。 第二部分補陽還五湯增強腦缺血耐受的作用和機制研究1.術后7d海馬CA1區(qū)組織病理學改變假手術組海

11、馬CA1區(qū)無明顯組織學損傷，組織學分級多為0級和1級，神經(jīng)元密度ND=214±28n/mm；缺血損傷組海馬CA1區(qū)損傷明顯，組織學分級多為2級和3級，神經(jīng)元密度ND=76±26n/mm，兩組相比有顯著性差異(P＜0.01)。BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學分級(多為1級和2級)明顯低于缺血損傷組(P＜0.05)，而神經(jīng)元密度(ND=153±31n/mm)明顯高于缺血損傷組(P＜0.05)又明顯低于假手術組(P＜0.05)。中藥干預組海馬C

12、A1區(qū)組織學分級(多為1級和0級)明顯低于缺血損傷組(P＜0.01)和BIT模型組(P＜0.05)，神經(jīng)元密度(ND=196±23n/mm)明顯高于缺血損傷組(P＜0.01)和BIT模型組(P＜0.05)。2.術后24h腦組織SOD活性和MDA含量變化與假手術組(SOD：302.34±26.31U/ml；MDA：6.85±0.37nmol/ml)相比，缺血損傷組SOD活性(175.82±36.72U/ml)明顯下降，而MDA含量(9.8

13、3±0.72nmol/ml)明顯升高(P＜0.01)。與缺血損傷組相比，BIT模型組SOD活性(243.25±28.80U/ml)明顯升高，而MDA含量(7.78±0.36U/ml)明顯下降(P＜0.05)。與BIT組相比，中藥干預組SOD活性(286.16±28.34U/ml)明顯升高，而MDA含量(6.23±0.40U/ml)明顯下降(P＜0.05)。 3.術后7d海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達變化與假手術組(Bax

14、：12.35±2.23。bcl-2：5.17±1.34)相比，缺血損傷組Bax(53.96±1.42)表達明顯增多(P＜0.01)，而bcl-2表達(5.77±1.22)雖有增多趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與缺血損傷組相比，BIT模型組Bax表達(22.59±1.83)明顯減少(P＜0.01)，而bcl-2表達(21.14±1.21)明顯增多(P＜0.01)。與BIT模型組相比，中藥干預組Bax表達(15.82±1.40)明顯

15、減少(P＜0.05)，bcl-2表達(28.43±1.43)明顯增多(P＜0.05)。 結論1.通過夾閉雙頸總動脈導致昆明小鼠前腦缺血20min，可引起明顯的海馬組織損傷，主要表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)組織學分級升高，神經(jīng)元密度降低，而補陽還五湯對小鼠腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷具有明顯的對抗作用。 2.補陽還五湯能夠明顯提高缺血腦組織SOD活性，并降低MDA含量，從而增強腦組織抗氧化應激能力，減輕氧自由基損傷；同時，補陽還五湯能

16、夠明顯增強腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)抗凋亡因子bcl-2蛋白表達，降低促凋亡因子Bax蛋白表達，上調bcl-2/Bax比例，從而抑制細胞凋亡，減輕腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷。這可能是本方抗腦缺血損傷的重要機制。 3.以6min腦缺血作為預處理(CIP)，可對間隔2d后20min腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷產(chǎn)生一定的保護作用，證實腦缺血耐受現(xiàn)象在昆明小鼠前腦缺血模型中同樣存在。但是6min預缺血的腦保護作用是有限的，補陽還五湯能夠對