MicroRNA-125a在胃癌中表達水平的研究及其臨床意義.pdf

1、背景和目的:
　　胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類健康。據(jù)統(tǒng)計，在全球全部惡性腫瘤中，胃癌發(fā)病率排在肺癌、乳腺癌、結直腸癌后居第四位，而死亡率在肺癌之后居第二位，2008年全球新診斷出的胃癌約990，000例，死亡人數(shù)高達約738，000。盡管在一些國家和地區(qū)的發(fā)病率和死亡率有所降低，但包括我國在內的東亞地區(qū)發(fā)病率仍較高。我國每年新確診的患者約40萬，胃癌仍然是我國三大常見惡性腫瘤之一。
　　盡管目前胃癌

2、的治療手段得到了長足進步，除了手術治療以外，各種輔助放、化療及免疫治療的發(fā)展在一定程度上提高了臨床的治療效果，然而，伴有淋巴結轉移的晚期胃癌患者的預后仍然很差。因此，有部分學者認為，某些基因的存在可能有助于胃癌細胞向惡性潛能發(fā)生轉化，但具體要鑒別究竟哪些基因可以用來預測胃癌的預后和復發(fā)仍然需要更加深入的研究。
　　MicroRNA(miRNA)一種成熟的、小的、非編碼的、單鏈、高度保守的內源性RNAs，通過與靶信使RNA(mRNA

3、)3'端的非翻譯區(qū)(3'UTR，untranslated regions)，近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而抑制靶蛋白編碼基因的翻譯及表達。miRNA在細胞核及細胞質中首先被轉錄為長的、初始片段pri-miRNAs，然后經過RNA內切酶Ⅲ Drosha剪切等一系列復雜過程，生成長度70 nt的miRNA前體(pre-miRNAs)，最后pre-miRNAs被轉運到細胞質，被Dice

4、r酶切割成成熟的miRNA。到目前為止，人們已經發(fā)現(xiàn)了幾百種miRNA。在人類的所有基因譜中，大約有30％的miRNAs參與調節(jié)蛋白質編碼的各種基因。因此，miRNA具有多種生物學功能，調控多種生物學過程，參與細胞的發(fā)育、代謝、分化、增殖、自噬和凋亡等。miRNA與人類腫瘤的發(fā)生關系密切，miRNA對腫瘤的調控研究已發(fā)展成為生物醫(yī)學最熱門的研究領域之一，它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉移過程中有異常的表達，并且可以發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作

5、用。
　　越來越多的證據(jù)表明:miR-125家族在腫瘤組織中存在異常表達。miR-125家族由miR-125a，miR-125b-1及miR-125b-2組成，miR-125a位于染色體19q13上，有miR-125a-3p和miR-125a-5p兩種成熟體，分別來自miR-125a前體的3'端和5'端。miR-125家族在很多實體腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能。因靶基因的不同，miR-125a的表達水平不一致。在多種實體腫瘤中檢測到mi

6、R-125a的表達減少，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及膠質母細胞瘤。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p的表達降低與胃癌發(fā)展?jié)撃芟嚓P。此外，也有報道稱被研究者普遍忽視的miR-125a-3p，在胃癌病變中與miR-125a-5p有著幾乎相同的功能。除此之外，也有報道指出，在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)miR-125a的編碼區(qū)域發(fā)生突變可減少的miR-125a的表達，以上這些結果提示miR-125a的-5p和-3p可以作為抑癌基因，并下調miR-125a的表

7、達，因此可能用作胃癌診斷和治療的基因遺傳標記。
　　在乳腺癌中，miR-125a的編碼區(qū)域發(fā)生突變可下調miR-125a的表達，那么miR-125a的編碼區(qū)域在胃癌中是否也發(fā)生了突變？這種突變是否也能導致其表達下調？具體的分子機制如何？基于對以上問題的思考，在本研究中，我們首先檢測了miR-125a-5p和-3p在人胃腺癌細胞系（MGC-803和BGC-823）以及胃癌組織與其鄰近的正常胃組織表達水平。然后，我們對胃癌患者和健康志

8、愿者（對照組）的miR-125a的編碼區(qū)域進行基因分型，發(fā)現(xiàn)pri-miR-125a種系突變與胃癌發(fā)生和miR-125a的表達下調相關，這些結果表明miR-125a是胃癌的抑癌基因。
　　方法:
　　1.收集胃癌患者的臨床組織標本。自2012年4月至2013年1月期間，我們共收集了山東省淄博市中心醫(yī)院75對經病理證實的胃癌組織標本和距離癌灶5cm以上的癌旁組織標本（經HE染色證實）。所有患者均未接受過化療、放療或者其他治療。

9、手術獲取的新鮮組織標本于20min內立即用液氮浸沒降溫，并置于液氮罐中保存。血液標本抽取287名健康漢族志愿者的靜脈血。
　　2.人胃癌細胞系體外培養(yǎng)實驗。人胃腺癌細胞系MGC-803和BGC-823，均購自中國科學院上海生命科學研究院，采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　3.通過RT-qPCR法檢測胃癌組織及癌旁組織miR-125a-5p和miR-125a-3p的表

10、達水平。RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，按照說明書進行操作。單鏈cDNA的合成采用MicroRNA Reverse Transcription試劑盒。按照TAKARA公司的熒光定量試劑盒的操作說明進行熒光定量PCR檢測。
　　4.DNA的收集和基因分型。胃癌組織和癌旁組織DNA的提取及血液樣本的DNA提取采用TIANamp血液組織細胞基因組提取試劑盒。DNA樣本使用標準的PCR方法進行擴增。PCR產物應

11、用ABI公司的3730 xl測序平臺正向測序。使用軟件DNAMAN和Chromas Lite對測序結果進行分析。用于miR-125a的PCR測序引物分別為:上游5'-TGTGTC TCT TTC ACA GTG GAT C-3'和下游5'-CCA TCG TGT GGG TCT CAA G-3'。
　　5.MiRNA的二級結構預測。在RNAfold網站操作獲得對217個bp的pri-miR-125a二級結構，其中包括對突變位點的預

12、測。
　　6.MiR-125a的表達載體構建。為構建miR-125a的表達載體，將1016-nt片段對應pri-miR-125a，和它的側面區(qū)域（之前確認兩個區(qū)域等位基因）從cDNA克隆到pcDNA3.1載體上。序列產生的兩個向量經過直接測序證實，唯一的區(qū)別是突變位點。引物分別是miR-125a-F/XhoI,5'-CCG CTC GAG GGT AGG AGG TTG TAT AGT TGA GGA GG-3'以及miR-125

13、a-R/XbaI,5'-GCT CTA GAC CTC TGG GCC TCT CCT GC-3'。
　　7.細胞增殖實驗（CCK8法）。將MGC-803和BGC-823胃癌細胞接種至96孔板中，每孔加入5×103個細胞，以DMEM培養(yǎng)過夜。然后用不同類型的miR-125a載體進行細胞轉染，以pcDNA3.1空載體作為對照組。轉染后48小時，每孔加入10ul的CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，于450nm處測定讀取吸光度值。
　　8

14、.雙熒光素酶報告基因分析。將ERBB2基因3'UTR片段(618bp)克隆插入到pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target載體上。將MGC-803和BGC-823胃癌細胞以2×105個細胞/孔接種于48孔板，24h后將miR-125a表達載體及雙熒光素酶載體共同轉染入胃癌細胞，具體方法按照Invitrogen公司的產品說明進行。采用Dual-Luciferase Assaysystem進行檢測。實驗均設三復

15、孔，并重復三次。
　　9.統(tǒng)計學分析。應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩獨立組間的資料采用t檢驗，偏態(tài)分布計量資料組間差異比較采用秩和檢驗，以P＜0.05認定為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.胃癌組織中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表達均減少。為了探索miR-125a在胃癌發(fā)生中的作用，我們使用RT-qPCR的分析了75對胃癌組織和癌旁組織mi

16、R-125a的表達模式，將三例患者的癌組織RNA設為一組（75對共分成25組）。實驗結果顯示:胃癌組織中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表達水平分別減少了92％(23/25)和80％(20/25)。
　　2.pri-miR-125a編碼區(qū)域發(fā)生種系突變。核苷酸變異可以改變miRNA的表達，并證實與多種人類疾病相關。我們從胃癌組織中提取DNA進行pri-miR-125a編碼區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)5位患者攜帶G等位基因，存在于

17、miR-125a-5p中+43和pri-miR-125a中+29。此外，測序結果發(fā)現(xiàn)癌旁組織（正常胃組織）與胃癌組織的基因型相同。此外，我們對同一地區(qū)287名健康志愿者的G等位基因進行檢測，未發(fā)現(xiàn)攜帶G等位基因的人，在1000genomes數(shù)據(jù)庫中也沒有找到這種等位基因。既然來自同一地區(qū)的健康人中沒有攜帶G等位基因，因此在胃癌患者中G等位基因的存在不太可能是由于奠基者效應所致。上述這些結果表明，突變的pri-miR-125a可能與胃癌的

18、發(fā)生有關。
　　3.G變異可以增加pri-miR-125a穩(wěn)定性并下調miR-125a的表達。為了研究這種突變的功能，我們首先比較了變異及未變異pri-miR-125a的二級結構。結果顯示:G等位基因會導致在莖環(huán)的大小一個明顯的變化（從8核苷酸循環(huán)到6核苷酸循環(huán)，從10核苷酸配對到12核苷酸配對），△G從-74.30kcal/mol.減少到-77.08kcal/mol。使用RT-qPCR和兩種不同的表達載體攜帶miR-125a-5

19、p等位基因，我們量化成熟miR-125-5p在兩個胃癌細胞MGC-803和BGC-823中的表達水平。發(fā)現(xiàn)突變的存在使成熟miR-125-5p表達水平減少了約40％，這與RT-qPCR的分析結果相一致。
　　4.miR-125a的表達下降，從而減弱了miR-125a對ERBB2的抑制效果及對胃癌細胞增殖的抑制作用。ERBB2基因，有報道認為它是miR-125-5p的靶基因，屬于表皮生長因子受體（EGFR/ERBB）家族成員，在許多

20、類型的癌細胞中呈過表達，并促進癌細胞增殖。我們使用了ERBB23'UTR研究突變對ERBB2基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)轉染miR-125a可減弱ERBB2的表達，這點在攜帶G基因的細胞中更加明顯。為研究ERBB2的體內表達情況，我們采用RT-qPCR法檢測胃癌和癌旁組織（正常胃組織）中ERBB2 mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中的ERBB2表達水平顯著升高。
　　5.基于ERBB2的功能，miR-125a表達下調可促進癌細胞增殖。我們采

21、用細胞增殖實驗，探討不同miR-125a對胃癌細胞增殖活性的影響。首先獲得不同的pri-miR-125a表達載體，分別攜帶A、G等位基因;然后將這兩種不同的pri-miR-125a表達載體轉染進入MGC-803和BGC-823胃癌細胞。正如預期所料，我們發(fā)現(xiàn)MGC-803胃癌細胞的增殖受到顯著抑制（與對照組相比，P=0.0008 vs.P=0.0067），A到G的變異對細胞的影響約20％(P=0.023)。攜帶A等位基因的pri-miR

22、-125a也能抑制BGC-823胃癌細胞的增殖(P=0.0075)，但G變異的影響不大。
　　結論:
　　1.胃癌組織中miR-125a-5p和miR-125a-3p的表達水平較癌旁正常組織明顯降低。
　　2.pri-miR-125a編碼區(qū)域發(fā)生了種系突變。
　　3.G變異可以增加pri-miR-125a穩(wěn)定性并減少miR-125a的表達。
　　4.miR-125a的表達減少，減弱了miR-125a對ERB