家蠶Bm12細胞中綠僵菌素A結合蛋白的初步研究.pdf

1、綠僵菌素A（DA）是由金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae產生的一種環(huán)縮羧肽類次生化合物，具有殺蟲、抗病毒等生物活性，但是其作用機理尚不清楚。分離鑒定綠僵菌素A結合蛋白，明確其分子組成與結構及其與其他蛋白的相互作用關系，才能從根本上認識綠僵菌素A的分子作用機理。因此，本研究以家蠶Bombyx mori Bm12細胞為材料，利用酶解和電泳技術分離DA結合蛋白，應用質譜技術初步鑒定DA結合蛋白，通過同源建模和分子對接評估

2、這些蛋白與DA結合作用；最后采用RNAi技術沉默相關轉錄因子，結合熒光定量PCR（qPCR）技術，明確DA處理或沉默TOLL和IMD信號通路相關轉錄因子后家蠶抗菌肽cecropin B和gloverin4基因以及BmRel/BmRelish基因表達的變化。主要研究結果如下：
　?。?）綠僵菌素A結合蛋白的分離與鑒定
　　用200μg/mL DA處理Bm12細胞6h后，提取總蛋白質，然后分別用鏈蛋白酶與蛋白酶K降解所提取的蛋白

3、1、3、5 min，再進行電泳分離，結果發(fā)現(xiàn)，蛋白酶K降解后，DA處理的細胞與對照相比，增加三個電泳條帶（A、B1、B2）；而鏈蛋白酶降解的蛋白則沒有發(fā)現(xiàn)差異條帶。進而，將這些差異蛋白條帶進行質譜鑒定，分析發(fā)現(xiàn)A、B1、B2三個條帶中相同的蛋白質有112種，分子質量介于50~100 KDa之間。
　?。?）綠僵菌素A結合蛋白的同源建模與分子對接
　　從上述112種選取得分較高的26個蛋白，采用MOE2014.09軟件對其進行

4、同源建模和分子對接分析。結果顯示：26個蛋白與 DA對接的自由能介于-9.93~-5.46 kcal/mol之間，尤其是其中7種蛋白其對接自由能小于-8.00 kcal/mol，顯示出與DA具有良好的結合效果。該26種蛋白功能涉及基因表達調控、分子伴侶、蛋白降解、蛋白合成和細胞結構蛋白等，其中基因表達調控蛋白6種，分子伴侶5種，蛋白降解酶4種，蛋白合成相關蛋白3種，細胞結構蛋白3種，能量代謝相關蛋白2種，免疫功能相關蛋白1種，跨膜運輸相

5、關蛋白1種，以及功能未知蛋白1種。
　　（3）綠僵菌素A對家蠶抗菌肽cecropin B和gloverin4基因表達的影響
　　DA能引起抗菌肽cecropin B基因表達上調和gloverin4基因表達下調。利用特異性siRNA分別沉默轉錄因子基因BmRelish1、BmRelish2、BmRel后，發(fā)現(xiàn)當單獨沉默轉錄因子BmRelish2基因時，cecropin B和gloverin4基因表達下調，說明這兩種抗菌肽的合成

6、均通過IMD信號通路調控。當沉默BmRelish1或BmRel基因及DA處理聯(lián)合作用時，cecropin B基因顯著下調，說明在抑制cecropin B的合成時，DA與轉錄因子BmRelish1或者BmRel之間存在密切的協(xié)同效應；同樣，在促進gloverin4的合成時，DA與轉錄因子BmRelish2之間也存在著協(xié)同效應。
　　（4）綠僵菌素A影響轉錄因子BmRel/BmRelish調控基因表達
　　考察了DA對上述轉錄因

7、子調控Bm045、Bm066和Bm133基因的影響，結果發(fā)現(xiàn)，Bm045和 Bm066基因表現(xiàn)相似，當單獨沉默BmRelish1基因或者DA處理時，兩個基因均下調表達，當沉默BmRelish1基因和DA處理聯(lián)合作用時，都上調表達；單獨沉默BmRelish2基因時，Bm045和 Bm066基因表達上調，但是，沉默BmRelish2基因和DA處理聯(lián)合作用時，都下調表達；沉默BmRel基因和DA聯(lián)合作用則不能引起這兩個基因表達的變化。對于Bm