ESD蛋白增強Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導抑制口蹄疫病毒的復制.pdf

1、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）感染PK-15細胞后，其復制產(chǎn)生的正鏈RNA能夠被細胞質(zhì)中的模式識別受體MDA5識別。MDA5招募下游接頭蛋白VISA，VISA不僅能夠與TRAF6相互作用，通過IKK復合物磷酸化修飾I?B?，使其與NF-?B分離后被降解，NF-?B轉(zhuǎn)移到細胞核中；VISA而且能夠招募MITA，與蛋白激酶TBK1相互作用，從而磷酸化修飾IRF3，磷酸化的IRF3通過形成二

2、聚體，從而轉(zhuǎn)移到細胞核中。進入細胞核的NF-?B和IRF3誘導細胞中I型干擾素（IFNs）和多種ISGs等抗病毒因子的轉(zhuǎn)錄和表達，引起抗病毒天然免疫反應。
　　ESD的酶活性與很多疾病的發(fā)生密切相關，然而，ESD參與調(diào)控天然免疫信號轉(zhuǎn)導，發(fā)揮抗病毒作用的機制目前還沒有相關報道。課題組前期轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)結(jié)果表明，F(xiàn)MDV感染PK-15細胞后，ESD的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，表明ESD與FMDV的感染存在一定關聯(lián)。在本研究中，我們通過病

3、毒感染實驗發(fā)現(xiàn)，隨著FMDV在PK-15細胞中感染時間的延伸，ESD的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著上調(diào)。我們進一步擴增了豬的ESD基因，構建了豬ESD基因的真核表達質(zhì)粒。在PK-15細胞中過表達ESD蛋白后接種FMDV，發(fā)現(xiàn)FMDV的復制水平顯著下降，且呈劑量依賴性。同時借助siRNA干擾技術，下調(diào)表達PK-15細胞中的內(nèi)源性ESD蛋白，然后接種FMDV，發(fā)現(xiàn)FMDV的復制水平顯著上升。通過過表達和干擾實驗，我們證實了ESD能夠抑制FMDV

4、的復制。
　　為了進一步探究ESD抑制FMDV復制的分子機制，我們檢測了病毒感染過程中ESD蛋白對I型干擾素信號通路下游多個抗病毒干擾素刺激基因（ISGs）表達的影響，結(jié)果表明：過表達或下調(diào)表達ESD，F(xiàn)MDV誘導的ISG15，MX1，ISG54，RIG-I，PKR和GBP1的mRNA表達水平也呈相應的上調(diào)或下調(diào)變化。為探究ESD是否能夠調(diào)控I型干擾素信號轉(zhuǎn)導，我們開展了IFN-β啟動子熒光素酶報告實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESD能夠促進Se

5、V誘導的IFN-β的激活，并呈劑量依賴性。為進一步揭示 ESD如何調(diào)控 I型干擾素信號轉(zhuǎn)導，我們開展了 I型干擾素通路分子過表達激活IFN-β啟動子熒光素酶報告系統(tǒng)實驗，結(jié)果表明 ESD能夠提高 IRF3以及它的上游信號分子（RIG-I-CARD，MDA5，VISA和TBK1）誘導的IFN-β的激活，但不影響IRF7誘導的IFN-β的激活，因此，我們推測ESD可能通過靶向IRF3來增強I型干擾素信號轉(zhuǎn)導。為證實ESD是否影響IRF3介導

6、的信號轉(zhuǎn)導，我們又從蛋白水平上分別檢測了MDA5，VISA，TBK1，p-TBK1，IRF3， p-IRF3和病毒蛋白表達變化，結(jié)果表明：過表達ESD后，VISA，TBK1和IRF3表達水平變化不明顯，p-IRF3表達水平升高，F(xiàn)MDV復制水平下降；下調(diào)表達 ESD后，VISA，TBK1和 IRF3表達水平變化不明顯，p-IRF3表達水平減少，F(xiàn)MDV復制水平上升。這些結(jié)果表明ESD蛋白通過增強IRF3的磷酸化水平來促進I型干擾素信號轉(zhuǎn)