中國葡萄屬野生種芪合成酶基因載體構建及轉化煙草研究.pdf

1、　　白藜蘆醇作為葡萄屬植物的抗逆代謝物質—植保素(phytoalexin)，是葡萄屬植物對病原菌或其它各種誘發(fā)因子脅迫下迅速在細胞中累積的一種次生代謝物質，它在細胞中的積累可以提高植物的抗病性。本研究是在獲得中國葡萄屬野生種華東葡萄白河-35-1芪合成酶基因(STS)的基礎上構建中國葡萄屬野生種芪合成酶基因植物表達載體，并將其轉入根癌農桿菌GV3101中，然后通過農桿菌介導法將STS基因導入煙草，借以初步探討芪合成酶基因在煙草中的轉化和

2、表達情況，為其今后在葡萄屬植物上的應用提供依據(jù)。主要研究結果如下： 1.中國葡萄屬野生種芪合成酶基因的克隆、序列測定 根據(jù)本課題組獲得的中國葡萄屬野生種華東葡萄白河-35-1芪合成基因cDNA全長序列，設計特異引物，并進行了修飾和改造，即增加了與植物表達載體pWR306相匹配的限制性內切酶酶切位點。 2.植物中間表達載體的構建及鑒定　　利用DNA重組技術，將質粒pSB166中包含ED35s-Ω-MCS-UTT-

3、TNOS的一段核苷酸序列定向克隆到質粒pCAMBIA1303上，經酶切、電泳鑒定表明，已成功構建了植物中間表達載體pWR306。 3.中國葡萄屬野生種芪合成酶基因植物表達載體的構建　　雙酶切重組質粒pGEM-T-STS及表達載體pWR306，將STS基因片段與線性表達載體pWR306進行定向連接，構建了芪合成酶基因的植物表達載體pWR-STS,通過酶切、電泳鑒定，STS基因已成功構建到植物表達質粒pWR306中，將此克隆命名為

4、pWR-STS。 4.重組質粒pWR-STS導入根癌農桿菌GV3101　　采用改進凍融法，將重組質粒pWR-STS導入農桿菌GV3101中，在卡那霉素和慶大霉素的平板上篩選陽性克隆，至有單菌落出現(xiàn)，進行菌落直接PCR和提取質粒、PCR擴增檢測，結果表明重組質粒已導入農桿菌GV3101中。 5.煙草遺傳轉化及檢測　　通過對影響農桿菌介導煙草遺傳轉化的幾個主要因素的探討，確定了各主要影響因素的值。利用綠色熒光蛋白檢測系統(tǒng)