MiRNA205在大腸癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA205在大腸癌組織、對(duì)應(yīng)的正常黏膜中的表達(dá)水平,分析其表達(dá)水平與大腸癌患者各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。同時(shí)進(jìn)一步應(yīng)用平板克隆實(shí)驗(yàn)、MTT比色分析法和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA205對(duì)大腸癌細(xì)胞的增殖、克隆、遷移和侵襲能力等過(guò)程的影響。探討miRNA205作為腫瘤標(biāo)記物對(duì)大腸癌的診斷價(jià)值,進(jìn)一步闡明miRNA205在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的生物功能,為大腸癌的早期診斷

2、、治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、收集2013年4月-8月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科37對(duì)新鮮大腸癌組織及癌遠(yuǎn)端5cm正常大腸粘膜組織。
　　2、應(yīng)用 Realtime-PCR法檢測(cè)大腸癌組織及正常黏膜組織中 miRNA205的表達(dá)水平,分析miRNA205的表達(dá)水平與大腸癌各臨床病理特征的關(guān)系。
　　3、選取5種大腸癌細(xì)胞株(DLD-1、Caco-2、colo320、HT29、HCT116)進(jìn)

3、行培養(yǎng),檢測(cè)各細(xì)胞株中miRNA205的表達(dá)情況。
　　4、在大腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miRNA205,并設(shè)對(duì)照組,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miRNA205的表達(dá)水平。
　　5、通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染miRNA205前后HCT116細(xì)胞集落形成情況。轉(zhuǎn)染miRNA205后1天、2天、3天、4天、5天分別用MTT比色分析法檢測(cè)5個(gè)時(shí)段OD值,繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)觀察miRNA20

4、5轉(zhuǎn)染前后HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力的改變。
　　6、應(yīng)用graphpad軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間配對(duì)樣本采用配對(duì) t檢驗(yàn),兩組間獨(dú)立樣本采用非配對(duì) t檢驗(yàn),均以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、miRNA205在37例大腸癌組織及其鄰近正常黏膜中的表達(dá)水平分別為
　　1.171E-07±1.19E-08和2.623E-07±3.42E-08,大腸癌組織

5、中 miRNA205表達(dá)水平明顯低于正常黏膜中miRNA205的表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。2、根據(jù)大腸癌中 miRNA205的表達(dá)水平與臨床各病理參數(shù)的比較發(fā)現(xiàn),miRNA205的表達(dá)與患者年齡、性別和分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān),所有對(duì)比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。)
　　3、miRNA205在DLD-1、Caco-2、Colo320、HT29、HCT116中的表達(dá)水平不同,結(jié)果以DLD-1中miR

6、NA205的含量為單位1,其他細(xì)胞系與之比較,Caco-2中為302.76,HT29中為41.96,Colo320中為0.084,HCT116中為1.63。
　　4、在HCT116大腸癌細(xì)胞株中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染了miR-205mimics組)和對(duì)照組(NS)在24小時(shí)候檢測(cè)miRNA205的表達(dá)情況,對(duì)照組設(shè)定為1,轉(zhuǎn)染組miRNA205表達(dá)量為57861.68。
　　5、在 HCT116細(xì)胞的克隆實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組和

7、對(duì)照組間細(xì)胞集落數(shù)有明顯差異,實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染了 miR-205mimics組)細(xì)胞集落形成數(shù)量較對(duì)照組少,集落體積明顯小于對(duì)照組。
　　6、HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA205后1天、2天、3天、4天、5天,通過(guò)MTT比色分析法檢測(cè)OD值發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞中miRNA205的含量不影響細(xì)胞的增殖,第一天:(0.30125、0.313);第二天:(0.52875、0.56625);第三天:(0.83225、0.9108);第四天:(

8、1.45667、1.283);第五天:(2.1617、2.2623)。結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7、HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA205后,細(xì)胞的遷移能力減弱,侵襲能力無(wú)明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1、發(fā)現(xiàn) miRNA205在大腸癌中低表達(dá),表明 miRNA205在大腸癌的發(fā)生中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　2、miRNA205能抑制大腸癌細(xì)胞 HCT116的克隆形成和遷移能力,深入研究miRNA205抑癌機(jī)制可以為闡明大腸癌